王水兵 李想

【摘 要】 熒光原位雜交技術(shù)是近30多年不斷發(fā)展起來(lái)的一種改變細(xì)胞遺傳學(xué)研究方式的技術(shù)，它基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使用被熒光素標(biāo)記的DNA探針與樣本細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，從而獲得細(xì)胞核內(nèi)染色體或基因狀態(tài)信息。未來(lái)的FISH技術(shù)也將結(jié)合“芯片實(shí)驗(yàn)室”微流控芯片技術(shù)與自動(dòng)化FISH檢測(cè)設(shè)備，將極大地拓展熒光原位雜交技術(shù)的應(yīng)用。本文主要討論了FISH技術(shù)的技術(shù)特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，以及綜述了近年來(lái)的主要技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用情況。

【關(guān)鍵詞】 熒光原位雜交技術(shù) 現(xiàn)狀 應(yīng)用前景

一、熒光原位雜交技術(shù)及標(biāo)記物的選擇

在FISH技術(shù)未成熟之前，放射性核素探針被常用于檢測(cè)染色體DNA基因是否發(fā)生突變，由于放射性核素探針?lè)ú僮鲝?fù)雜、探針不穩(wěn)定、且涉及放射性同位素，同位素標(biāo)記法一直沒(méi)有得到有效的進(jìn)展。隨后FISH技術(shù)日益成熟，也廣泛用于醫(yī)學(xué)細(xì)胞診斷中，相對(duì)于前者來(lái)說(shuō)，F(xiàn)ISH具有穩(wěn)定性好、操作安全、結(jié)果迅速、空間定位準(zhǔn)確、干擾信號(hào)少，通過(guò)一張玻片可以標(biāo)記多種顏色探針等優(yōu)點(diǎn)。

在FISH技術(shù)中，熒光標(biāo)記物作為一個(gè)重要的載體在醫(yī)學(xué)診斷、藥物篩選等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。人們利用熒光標(biāo)記的多肽來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選。在科研和臨床試驗(yàn)中，熒光染料基本涉及從紫外光、可見(jiàn)光、紅外等整個(gè)光譜。由于靈敏度高，操作方便的熒光染料，漸漸取代了放射性同位素作為標(biāo)記物，廣泛應(yīng)用于熒光免疫、探針以及細(xì)胞染色等。

例如，我們常見(jiàn)的核酸染料，可作為背景對(duì)照，諸如我們常見(jiàn)的DAPI就是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。熒光探針標(biāo)記物有熒光染料、生物素、稀土金屬等類(lèi)別。其中，生物素與其他熒光標(biāo)記物相比，具有安全可靠、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

二、熒光標(biāo)記技術(shù)與方法

熒光探針標(biāo)記物技術(shù)有缺口平移標(biāo)記法、PCR標(biāo)記法、DNA纖維技術(shù)等多種方法。采取的技術(shù)有多元熒光原位雜交技術(shù)、比較基因組雜交技術(shù)等技術(shù)。

例如，缺口平移標(biāo)記法是一種最常用的標(biāo)記雙鏈DNA探針的方法，通過(guò)用DNA聚合酶的活性將三磷酸脫氧核糖核苷與新合成的DNA鏈相結(jié)合中，從而得到DNA探針。對(duì)于熒光標(biāo)記技術(shù)，發(fā)展已經(jīng)較為完善，比較基因組雜交技術(shù)通過(guò)單次雜交實(shí)驗(yàn)就可以對(duì)某一腫瘤細(xì)胞乃至整個(gè)基因組的染色體的變化進(jìn)行診斷，其基本原理是用不同的熒光染料通過(guò)缺口平移法分別標(biāo)記腫瘤組織和正常細(xì)胞或組織的DNA，得到探針，并與正常人細(xì)胞染色體進(jìn)行雜交，在染色體上熒光強(qiáng)度的不同來(lái)反映DNA表達(dá)狀況的變化，借助于熒光顯微鏡就可對(duì)染色體復(fù)制數(shù)量的變化進(jìn)行定量研究診斷。

三、應(yīng)用于熒光原位雜交的技術(shù)

（一）微流控芯片技術(shù)

微流控技術(shù)是在微納尺度進(jìn)行加工，把生化領(lǐng)域中的樣品制備、分離、混合、反應(yīng)及檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)中各種功能的一種技術(shù)平臺(tái)。 微流控芯片是在基底材料上構(gòu)建微型管道、泵、閥、反應(yīng)池和連接器等功能器件，把常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)的采樣、稀釋、混合、分離、反應(yīng)和檢測(cè)等功能進(jìn)行集成，具有集成化、微型化和便攜化等優(yōu)點(diǎn)。將微流控技術(shù)應(yīng)用到FISH檢測(cè)能夠降低檢測(cè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的難度，提高相應(yīng)檢測(cè)設(shè)備的集成度。

（二）嵌入式自動(dòng)平臺(tái)技術(shù)

結(jié)合嵌入式自動(dòng)平臺(tái)，可以通過(guò)溫度控制模塊、驅(qū)動(dòng)電機(jī)模塊等電子自動(dòng)化設(shè)計(jì)，嵌入式系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)FISH檢測(cè)過(guò)程中的雜交染色的溫度、樣品進(jìn)樣、洗滌、干燥進(jìn)行控制。溫度傳感器檢測(cè)芯片夾具的溫度，通過(guò)場(chǎng)效應(yīng)管控制陶瓷加熱片的加熱功率。在硬件基礎(chǔ)上，需要借助合適的自動(dòng)控制算法才能夠?qū)崿F(xiàn)高效、穩(wěn)定的溫度控制。

（三）顯微鏡成像原理技術(shù)

熒光光學(xué)顯微鏡已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域研究的基本工具，是細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)得以建立和發(fā)展的重要基礎(chǔ)。，基于熒光成像技術(shù)的熒光顯微鏡由于其較高的空間、時(shí)間分辨率，對(duì)生物樣本的損傷小以及能夠?qū)μ囟繕?biāo)進(jìn)行標(biāo)記成像等特點(diǎn)，在分子生物學(xué)、細(xì)胞動(dòng)態(tài)生理特性及生物組織研究中，已經(jīng)成為重要的成像工具。

四、總結(jié)及未來(lái)展望

FISH技術(shù)用于診斷細(xì)胞是否發(fā)生了基因或染色體發(fā)生擴(kuò)增、缺失、融合或斷裂，能全面判斷患者某種染色體異常比例。由于采用的是特定的探針，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷準(zhǔn)確率提升，根據(jù)熒光的顏色信號(hào)就能得出診斷，比染色體分析獲得的結(jié)果更加可靠、更加迅速。但FISH技術(shù)因其操作過(guò)程繁瑣，對(duì)儀器設(shè)備要求較高、人工鏡檢勞動(dòng)強(qiáng)度大嚴(yán)重影響了效率，未來(lái)的方向?qū)⒒谖⒘骺匦酒夹g(shù)，結(jié)合人工智能、嵌入式技術(shù)設(shè)計(jì)搭建自動(dòng)實(shí)驗(yàn)裝置，對(duì)芯片上的樣本進(jìn)行控制，直接進(jìn)行樣本處理實(shí)驗(yàn)和FISH染色實(shí)驗(yàn)。FISH因?yàn)橛绕鋸V闊的應(yīng)用前景，在不久的將來(lái)，具有先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用的它將更大地造福人類(lèi)。

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作者簡(jiǎn)介：王水兵（1965-），男，漢族，湖北武漢市，武漢紡織大學(xué)電子與電氣工程學(xué)院工程中心，研究方向：醫(yī)療設(shè)備開(kāi)發(fā)