楊嬌嬌 陳翠娥 孫媛媛 郭金余 狄天偉 張希希

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是極低和超低出生體重兒最常見(jiàn)的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為肺泡和肺血管發(fā)育受限[1]，近年來(lái)發(fā)病率逐年升高[2]。BPD 預(yù)后差，患兒容易發(fā)生肺部感染、肺動(dòng)脈高壓，并影響神經(jīng)系統(tǒng)及生長(zhǎng)發(fā)育[3-5]。目前BPD 的治療措施有限，因此，尋找預(yù)防和治療BPD 的方法至關(guān)重要。β防御素-2（β defensin- 2，BD2）是抗菌肽的一員，具有廣譜抗菌活性，主要表達(dá)于呼吸道、皮膚及泌尿生殖道的黏膜上皮細(xì)胞[6]，可誘導(dǎo)、募集炎癥因子和免疫細(xì)胞，并影響細(xì)胞增殖和分化。人β 防御素-2（human β defensin-2，hBD2）在急性肺損傷、肺部感染、肺囊性纖維化、慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等肺部疾病中發(fā)揮重要作用[7-10]，并可通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-ɑ 的表達(dá)，保護(hù)綠膿桿菌引起的肺損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立高氧致BPD 動(dòng)物模型，并將重組hBD2 基因轉(zhuǎn)染至新生鼠肺組織，進(jìn)一步探討hBD2 對(duì)BPD 肺泡及肺血管發(fā)育的影響，為BPD治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 成年大鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（滬）2012-0002]，以雌雄比2∶1 配比合籠交配直到自然生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)象即為自然生產(chǎn)的新生SD 大鼠，共48 只，體重6～7g。

1.2 主要儀器和試劑 氧艙自動(dòng)控制系統(tǒng)（溫州醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心），24h HBO-2B 型控氧儀（浙江建德梅城電化分析儀器廠(chǎng)），測(cè)氧裝置（德國(guó)Envite C-Wismar 公司），二氧化碳檢測(cè)儀（德國(guó)Envite C-Wismar 公司），TG radient Thermoblock PCR 擴(kuò)增儀（德國(guó)Biometra 公司），腺病毒載體GV135（上海吉?jiǎng)P基因公司），E.col DH5α 感受態(tài)菌株（上海吉?jiǎng)P基因公司），Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen 公司），293T 細(xì)胞（上海吉?jiǎng)P基因公司），戊巴比妥鈉（浙江美谷生物科技有限公司），4%多聚甲醛（浙江美谷生物科技有限公司），PBS（浙江美谷生物科技有限公司），Trizol 裂解液（浙江美谷生物科技有限公司），3%過(guò)氧化氫溶液（浙江美谷生物科技有限公司），血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）免疫組化試劑盒一抗（美國(guó)Abcam 公司），二抗PV9001 兔鼠通用二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），二氨基聯(lián)苯胺顯色液（DAB）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒（廣州瑞生科技公司）。

1.3 動(dòng)物模型建立及分組 將48 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空氣組、高氧組、空載體組和hBD2 組4 組，每組12 只?？諝饨M置于21%氧濃度的空氣中，其他組均置于氧濃度90%的高氧箱內(nèi)14d。hBD2 組經(jīng)氣管穿刺氣管腔內(nèi)注入含有1×107/ml hBD2 和編碼基因的重組腺病毒25μl；空載體組注入等量對(duì)照腺病毒（不含hBD2 編碼基因）。室溫控制在20～25℃，給予動(dòng)物12h光照/12h 黑暗交替的環(huán)境，每日開(kāi)箱1h，稱(chēng)重、觀(guān)察大鼠狀態(tài)及更換代乳鼠。

1.4 hBD2 重組腺病毒載體構(gòu)建 hBD2 基因引物按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南設(shè)計(jì)，并在上下游引物的5′分別引入BamHI/AgeI 酶切位點(diǎn)，引物序列為：上游引物：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGGGTC -TTGTATCTC-3′，下游引物：5′-TCCTTGTAGTCCATACCTGGCTTTTTGCAGCATTTTG-3′，以質(zhì)?；蚓簽槟０暹M(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)236bp 的hBD2 cDNA。將hBD2 cDNA 片段用連接到具有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的線(xiàn)性腺病毒載體GV135 上，轉(zhuǎn)化進(jìn)E.col DH5α 感受態(tài)菌株中，篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒后用BamHI/AgeI雙酶切鑒定并測(cè)序，得到正確質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000 將表達(dá)hBD2 的腺病毒載體和腺病毒包裝質(zhì)?；旌喜⒐餐D(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞，熒光顯微鏡觀(guān)察GFP 的表達(dá)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，10～15d 后低速離心收集細(xì)胞并重懸，-80℃/37℃反復(fù)凍融，振蕩3 次，4℃、7 000r/min 離心收集病毒上清液，采用梯度稀釋法測(cè)定病毒滴度。

1.5 標(biāo)本采集 分別于大鼠出生后第7、14 天，每組隨機(jī)取6 只大鼠，1%戊巴比妥鈉0.01～0.02ml/g 腹腔注射麻醉，依次切開(kāi)胸前皮膚，鈍性分離皮下組織、肌肉，切斷肋骨，打開(kāi)胸腔，暴露肺組織，結(jié)扎右側(cè)支氣管，以4%多聚甲醛灌注左肺，浸入4%多聚甲醛固定，置于4℃冰箱保存，用作肺組織形態(tài)學(xué)分析及免疫組化，將右肺置于-80℃冰箱保存，用作肺組織qPCR 及ELISA 檢測(cè)。

1.6 肺組織hBD2 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qPCR法。取-80℃冰箱中凍存的大鼠肺組織約100μg，Trizol裂解液提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采? 500 RT-PCR 系統(tǒng)SDS 軟件，根據(jù)2-△△Ct方法計(jì)算hBD2 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果取平均值。

1.7 肺組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 4%多聚甲醛固定24h 后，切取左肺中葉，乙醇溶液梯度脫水，石蠟包埋，制作4～5μm 切片，經(jīng)HE 染色后觀(guān)察肺組織形態(tài)。光鏡下攝片，按照文獻(xiàn)的方法，測(cè)定肺泡輻射狀計(jì)數(shù)（radial alveolar count，RAC）[12]和平均內(nèi)襯間隔（the mean linear intercept，MLI）[13]。

1.8 肺組織VEGF 表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組化法。肺組織切片脫蠟，抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液處理，血清封閉，一抗4℃過(guò)夜（濃度為1:100），PBS 沖洗后加入二抗，37℃孵育50min，DAB 顯色，中性樹(shù)脂封片，鏡下觀(guān)察。用PBS 替代一抗作陰性對(duì)照。采用Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的染色區(qū)域的平均光密度（AOD）值，來(lái)反映VEGF 表達(dá)水平。

1.9 肺組織IL-6、IL-1β、TNF-ɑ、IL-10 表達(dá)水平檢測(cè)采用ELISA 法。稱(chēng)量組織塊100mg，加入預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液0.9ml，剪碎組織塊后倒入勻漿器中制備10%的組織勻漿，低溫低速離心15min，取500μl 的上清液備用，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定各炎癥因子表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組hBD2 基因構(gòu)建評(píng)估及病毒滴度測(cè)定 hBD2基因轉(zhuǎn)染24h 后即可在熒光顯微鏡下觀(guān)察到帶有綠色熒光的293T 細(xì)胞，見(jiàn)圖1（插頁(yè)），梯度稀釋法測(cè)定病毒滴度為1×109/ml，用稀釋液稀釋100 倍得到1×107/ml。

圖1 hBD2 基因轉(zhuǎn)染24h 后顯微鏡下所見(jiàn)（a：普通顯微鏡，×100；b：熒光顯微鏡，×100；c：普通顯微鏡，×200；d：熒光顯微鏡，×200）

2.2 4 組大鼠肺組織hBD2 mRNA 表達(dá)水平比較 在大鼠出生后第7、14 天，與hBD2 組比較，空氣組、高氧組、空載體組大鼠hBD2 mRNA 表達(dá)水平均明顯為低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 4 組大鼠肺組織hBD2 mRNA 表達(dá)水平比較

2.3 4 組大鼠肺泡發(fā)育情況比較 肺組織形態(tài)學(xué)顯示，隨日齡增加，空氣組大鼠肺組織發(fā)育逐漸成熟，肺泡明顯增多；高氧組及空載體組第7 天即可觀(guān)察到肺泡簡(jiǎn)單化，即表現(xiàn)為肺泡壁變薄，部分肺泡融合，第14 天時(shí)肺發(fā)育受阻現(xiàn)象更加明顯，肺泡腔擴(kuò)大，數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)紊亂，而hBD2 組肺泡發(fā)育受阻不明顯，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。第7、14天，高氧組和空載體組大鼠的RAC 和MLI 與空氣組、hBD2 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖2 4 組大鼠肺組織病理檢查所見(jiàn)（HE 染色，×100）

表2 4 組大鼠肺組織RAC 及MLI 比較

2.4 4 組大鼠肺組織VEGF 表達(dá)水平比較 肺組織VEGF 免疫組化染色后顯示VEGF 主要表達(dá)于肺泡上皮及肺間隔，隨大鼠日齡增長(zhǎng)，空氣組大鼠肺組織VEGF表達(dá)量逐漸增加，高氧組及空載體組大鼠肺組織VEGF表達(dá)量無(wú)增加，見(jiàn)圖3（插頁(yè)）。第7、14 天，高氧組和空載體組大鼠肺組織中AOD 值均明顯低于空氣組和hBD2 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖3 VEGF 在四組大鼠肺組織中的表達(dá)（免疫組化染色，×200）

表3 大鼠肺組織AOD 值比較

2.5 4 組大鼠肺組織TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 和IL-10 表達(dá)水平比較 第7、14 天，高氧組和空載體組肺組織TNFɑ、IL-1β 和IL-6 的表達(dá)明顯高于空氣組和hBD2 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；第7、14 天，高氧組、空載體組、hBD2 組肺組織IL-10 表達(dá)高于空氣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

早產(chǎn)兒尤其是極早早產(chǎn)兒出生時(shí)肺發(fā)育尚未成熟，處于小管期和囊管期，肺泡氣體交換功能?chē)?yán)重受阻，因此，早期的高濃度吸氧或機(jī)械通氣對(duì)于維持早產(chǎn)兒的生存是必需的。但是高濃度吸氧或機(jī)械通氣在改善了早產(chǎn)兒存活率的同時(shí)，亦使得BPD 發(fā)病率逐年升高[2]。BPD預(yù)后差，容易繼發(fā)肺部感染、肺動(dòng)脈高壓，同時(shí)影響早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及生長(zhǎng)發(fā)育。

表4 4 組大鼠肺組織炎癥因子表達(dá)水平比較（pg/ml）

防御素為富含半胱氨酸的陽(yáng)離子蛋白質(zhì)，包含16～50 個(gè)氨基酸，屬于抗菌肽家族，廣泛存在于人體皮膚和黏膜上皮細(xì)胞中，并在抵御病原微生物、介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)及抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用。hBD2 是第1 個(gè)發(fā)現(xiàn)的可誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽，其可通過(guò)破壞細(xì)菌磷脂膜的完整性，改變磷脂酶滲透性從而發(fā)揮直接滅菌作用[11]；局部組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，hBD2 表達(dá)增加，繼而募集中性粒細(xì)胞來(lái)清除病原體，同時(shí)刺激樹(shù)突狀細(xì)胞和記憶性T 細(xì)胞的趨化作用，進(jìn)一步發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷大鼠模型肺組織hBD2 的表達(dá)增加，其表達(dá)量與TNF-ɑ 的表達(dá)水平成正相關(guān)，提示hBD2 對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用[7]。在肺部感染模型中，外源性hBD2 可上調(diào)抑炎因子IL-4、IL-10 和IL-13 表達(dá)，并下調(diào)促炎因子IL-1ɑ、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8、IL-18 和TNF-ɑ 表達(dá)，證實(shí)了hBD2 可通過(guò)調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)，從而改善肺部感染[2，14-15]。Starner 等[16]研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒肺組織hBD2 表達(dá)量少，而足月兒肺組織hBD2 表達(dá)量明顯增加，提示hBD2 可作為肺發(fā)育不成熟的指標(biāo)之一。

炎癥是BPD 發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一，當(dāng)不成熟的肺暴露于高氧環(huán)境時(shí)，肺部炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，影響肺泡和肺血管發(fā)育，最終導(dǎo)致BPD。臨床研究表明，患BPD 的風(fēng)險(xiǎn)與血清中高水平和持續(xù)表達(dá)的多種炎癥介質(zhì)相關(guān)[17]。Koksal 等[18]檢測(cè)了102 例早產(chǎn)兒血清和支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平，顯示BPD患兒血清和支氣管肺泡灌洗液中TNF-ɑ、IL-1β 和IL-6均高于非BPD 患兒，說(shuō)明上述細(xì)胞因子在BPD 發(fā)病中可能起到關(guān)鍵作用。Oncel 等[19]發(fā)現(xiàn)TNF-ɑ 抑制劑依那西普能改善高氧暴露的鼠肺損傷，促進(jìn)肺泡成熟，抑制炎癥反應(yīng)，并減輕氧化應(yīng)激，對(duì)BPD 具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)顯示新生大鼠暴露于高氧環(huán)境后出現(xiàn)肺泡簡(jiǎn)單化，表現(xiàn)為RAC 減少及MLI 增大，同時(shí)，肺組織促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平升高，外源性hBD2 可增加RAC，減小MLI，改善肺泡發(fā)育，并可下調(diào)TNF-ɑ、IL-1β 及IL-6 表達(dá)。既往臨床研究表明，患BPD 的早產(chǎn)兒出生后24h 及2 周時(shí)血清IL-10 水平明顯低于非BPD早產(chǎn)兒[20]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)亦表明，重組IL-10 治療可減輕高氧對(duì)胎鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞的損傷[21]。本實(shí)驗(yàn)中，肺組織抑炎因子IL-10 在高氧組和空載體組較空氣組升高，hBD2 組表達(dá)更高，提示高氧環(huán)境下，新生鼠可能通過(guò)反應(yīng)性增加IL-10 表達(dá)來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，但作用輕微，hBD2 可通過(guò)促進(jìn)肺組織IL-10 表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)其抑炎作用。

VEGF 是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，由肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙、生存、增殖和分化，是整個(gè)胚胎期、胎兒期和生后肺血管生長(zhǎng)發(fā)育最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在建立正常肺形態(tài)和肺功能中發(fā)揮重要作用[22]。VEGF 表達(dá)水平可直接影響肺血管及肺泡發(fā)育，在BPD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Been 等[23]研究報(bào)道，BPD 患兒肺泡灌洗液中VEGF 表達(dá)水平明顯低于非BPD 患兒，且表達(dá)水平持續(xù)下降。在高氧致BPD 動(dòng)物模型中，亦發(fā)現(xiàn)VEGF 表達(dá)量顯著低于空氣對(duì)照組[24-27]，外源性VEGF 可改善高氧所致的的肺泡及肺血管發(fā)育受阻[24]。本實(shí)驗(yàn)顯示新生大鼠暴露于高濃度氧氣后，肺組織VEGF 表達(dá)減少，提示肺血管發(fā)育受阻，而外源性hBD2 干預(yù)后，肺組織VEGF 表達(dá)升高，提示hBD2 可改善高氧所致的新生鼠肺血管發(fā)育受阻。

綜上所述，hBD2 可改善BPD 新生鼠肺泡及肺血管發(fā)育受阻，與其抗炎機(jī)制相關(guān)，此研究為BPD 治療提供了新的理論依據(jù)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，筆者將進(jìn)行不同劑量hBD2 的對(duì)照研究以及進(jìn)一步的機(jī)制研究，以找到最佳的劑量及更全面的作用機(jī)制。