李鑫 徐潔 潘月龍

肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗已被認(rèn)為是結(jié)直腸癌及腺瘤的重要危險因素。胰島素/胰島素受體通路的過度激活能促進(jìn)有絲分裂和血管生成，是結(jié)腸癌發(fā)生的早期步驟[1]。脂聯(lián)素是一種主要由白色脂肪組織分泌的244 個氨基酸的蛋白質(zhì)，參與糖代謝和脂肪代謝，具有改善胰島素抵抗、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用。體內(nèi)的循環(huán)脂聯(lián)素水平還與患惡性腫瘤呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)Meta 分析結(jié)果提示脂聯(lián)素在結(jié)直腸癌及腺瘤患者中的水平低于正常健康人[2-4]。Sugiyamai 等[5]通過分子生物學(xué)實驗證實脂聯(lián)素通過活化磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMPK），進(jìn)而下調(diào)哺乳動物雷帕霉素標(biāo)靶信號通路（mTOR），從而起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。以往的研究表明，脂聯(lián)素在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[6-8]。脂聯(lián)素是否可以通過改善糖代謝、胰島素抵抗等抑制結(jié)直腸癌腫瘤生長和轉(zhuǎn)移目前尚缺乏相關(guān)實驗研究。為此，筆者設(shè)計本實驗，探討脂聯(lián)素對糖尿病相關(guān)結(jié)直腸癌的影響，分析相關(guān)通路變化，以期明確脂聯(lián)素對腫瘤抑制的作用靶點和分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和細(xì)胞株 4 周齡的雌性糖尿病小鼠（美國B6.V-Lepob/OlaHsd Harlan 實驗室）、小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株MCA38（浙江大學(xué)腫瘤研究所）。

1.2 主要試劑及設(shè)備 小鼠重組脂聯(lián)素（北京康肽生物科技有限公司），胰酶、FBS、青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（上海Healforce 公司），ELISA 試劑盒（美國ALPCO Diagnostics 公司），強(qiáng)生單鍵血糖儀（美國強(qiáng)生公司），TNF-α 試劑盒（上海欣博盛公司，EMC102a.48），IL-6 試劑盒（上海欣博盛公司，EMC004.48），IL-1β 試劑盒（上海欣博盛公司，EMC001b），XDS-500C 型顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司），5702R 型低速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），Ras 抗體（上海abcam 公司，ab52939），β-actin抗體（美國Proteintech 公司，60008-1-Ig），胰島素生長因子受體-2（IGF-2R）抗體（美國Proteintech 公司，20253-1-AP），c-Myc 抗體（美國Proteintech 公司，10057-1-AP），β-catenin 抗體（美國Proteintech 公司，51067-2-AP），過氧化物酶體增殖劑激活受體抗體γ（PPAR γ）抗體（美國Proteintech 公司，16643-1-AP），p21 活化激酶-1（PAK-1）抗體（美國Proteintech 公司，21401-1-AP），山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（上海碧云天公司，A0208），PBS（上海長島抗體診斷試劑公司，F(xiàn)L-2004），過硫酸銨（北京solarbio 公司，A8090），十二烷基硫酸鈉（SDS）（北京solarbio 公司，S8010），Tris（北京solarbio 公司，T8060），Tween-20（美國Amresco 公司，BYL40713），miniprotean3 cell 型電泳儀（上海BIO-RAD 公司）。

1.3 動物分組 將糖尿病小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成以下4 組（每組8 只）：皮下成瘤治療（SA）組：皮下成瘤+小鼠重組脂聯(lián)素；皮下成瘤對照（SC）組：皮下成瘤+0.9%氯化鈉溶液；肝轉(zhuǎn)移治療（LA）組：肝轉(zhuǎn)移+小鼠重組脂聯(lián)素；肝轉(zhuǎn)移對照（LC）組：肝轉(zhuǎn)移+0.9%氯化鈉溶液。按組別分別向小鼠腹腔注射小鼠重組脂聯(lián)素（5μg/d）或0.9%氯化鈉溶液至脊髓脫臼法處死。

1.4 動物實驗 依據(jù)相關(guān)研究，通過注射MCA38 細(xì)胞構(gòu)建結(jié)直腸癌皮下成瘤、肝轉(zhuǎn)移模型[9-10]。將小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株MCA38 培養(yǎng)在含10%的FBS、100U/ml 的青霉素和100U/ml 的鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)至指數(shù)生長期（約24h）后，制成單細(xì)胞懸液（濃度為5×107/ml）。按組別開始注射7d 后，SA 組、SC 組小鼠前肢腋下皮下注射MCA38 細(xì)胞懸液100μl，繼續(xù)飼養(yǎng)28d 后處死；LA 組、LC 組小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后仰臥固定，皮膚消毒后取左側(cè)肋下切口，逐層進(jìn)腹后暴露脾臟并游離至體腔外，MCA38 細(xì)胞懸液100μl 緩慢于脾臟包膜下注入，5min 后結(jié)扎脾門并摘除小鼠脾臟，止血后關(guān)腹，繼續(xù)飼養(yǎng)42d 后處死。

1.5 腫瘤體積及轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)記錄 SA 組、SC 組小鼠待局部成瘤后每隔3d 測量長徑和短徑計算腫瘤體積；LA組、LC 組小鼠處死后取出肝臟，計數(shù)轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)個數(shù)。

1.6 糖尿病相關(guān)指標(biāo)的檢測 采用ELISA 法。分別在SA 組、SC 組小鼠重組脂聯(lián)素或0.9%氯化鈉溶液注射前（第0 天）、皮下腫瘤注射前（第7 天）、腫瘤接種后（第14、21 天）、小鼠處死前（第28 天），或LA 組、LC 組小鼠重組脂聯(lián)素或0.9%氯化鈉注射液注射前（第0 天）、皮下腫瘤注射前（第7 天）、腫瘤接種后（第14、21、28、35天）、小鼠處死前（第42 天），小鼠尾靜脈取血，采用血糖儀檢測血糖濃度，檢測前小鼠空腹12h。使用ELISA 試劑盒檢測4 組小鼠處死前血液中糖尿病相關(guān)指標(biāo)脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）、瘦素（Leptin）、IGF-1、胰島素（Insulin）濃度的變化。

1.7 炎癥相關(guān)標(biāo)志物水平的檢測 采用ELISA 法。使用Th1/Th29-plex assay 超敏試劑盒測試小鼠處死前血液中炎癥相關(guān)標(biāo)志物TNF-α、IL-6、IL-1β 的濃度變化。

1.8 腫瘤組織病理學(xué)檢查及相關(guān)通路蛋白水平的檢測 所有小鼠處死后，腫瘤組織部分以10%中性甲醛溶液固定繼續(xù)病理切片觀察。采用Western blot 法檢測腫瘤組織中腫瘤相關(guān)通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、βcatenin、PPAR γ 及PAK-1 表達(dá)水平的變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間兩兩比較采用LSD-t法。采用GraphPad Prism 6 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)圖片的繪制。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠腫瘤體積及轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的比較 造模成功后12d 時SA 組、SC 組小鼠腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而16、20、24、28d 時，SA 組小鼠腫瘤體積均小于SC 組小鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。LA 組小鼠轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)平均為（5.4 1.34）個，與LC組（2.2 0.84）個比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。肝組織形態(tài)見圖1（插頁）。

圖1 肝組織形態(tài)（A 為LC 組，B 為LA 組）

表1 不同時間SA 組、SC 組小鼠腫瘤體積的比較（mm3）

2.2 4 組小鼠血糖濃度及ADPN、Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度的比較 隨著時間的增加，尤其14d 以后，相比SC 組、LC 組，SA 組和LA 組的小鼠血糖濃度均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖2、3；SA 組和LA 組小鼠ADPN 濃度均明顯升高，Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表2。

圖2 不同時間SC 組和SA 組小鼠血糖濃度（與SC 組比較，**P＜0.01）

圖3 不同時間LC 組和LA 組小鼠血糖濃度（與LC 組比較，**P＜0.01）

表2 4 組小鼠ADPN、Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度的比較

2.3 4 組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度的比較 相較于SC 組及LC 組，SA 組、LA 組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表3。

表3 4 組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度的比較

2.4 4 組小鼠腫瘤組織病理變化 HE 染色下，SC 組中，腫瘤細(xì)胞核大深染，核分裂現(xiàn)象較多，細(xì)胞排列緊密、規(guī)整；SA 組可見腫瘤細(xì)胞有所減少，細(xì)胞排列疏松、大小不一，并出現(xiàn)壞死組織，見圖4（插頁）。LC 組中，腫瘤細(xì)胞分化差，異型性明顯，胞質(zhì)少，核大深染且不規(guī)則，核分裂象易見；LA 組可見腫瘤細(xì)胞減少，核分裂象減少，出現(xiàn)組織壞死情況，見圖5（插頁）。

圖4 腫瘤組織病理變化（a-b:SC 組；c-d:SA 組；HE 染色，×200）

圖5 腫瘤組織病理變化（a-b:LC 組；c-d:LA 組；HE 染色，×200）

2.5 4 組小鼠IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPAR γ及PAK-1 表達(dá)水平的比較 SA 組、LA 組小鼠IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPARγ 及PAK-1 表達(dá)水平較SC 組及LC 組均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6、7、8。

圖6 各組基因蛋白表達(dá)電泳圖（A：SC 組；B：SA 組；C：LC 組；D：LA 組）

圖7 SC 組與SA 組腫瘤相關(guān)通路蛋白表達(dá)的比較（與SC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖8 LC 組與LA 組腫瘤相關(guān)通路蛋白表達(dá)的比較（與LC 組比較，*P＜0.05）

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，隨著化療藥物、靶向治療藥物的進(jìn)步和多學(xué)科協(xié)作治療的發(fā)展，使得療效有了明顯的提高，但腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移仍是治療失敗的主要原因[11]。結(jié)直腸癌在所有惡性腫瘤中發(fā)病數(shù)居第3 位，死亡數(shù)亦高居第3 位[12]。流行病學(xué)研究表明，糖尿病患者發(fā)生乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤的風(fēng)險明顯高于正常人。相較于普通人群，2 型糖尿病患者罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險增加了高達(dá)3 倍[13]。高胰島素血癥和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）在結(jié)腸細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長、增殖和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮了重要作用[14-16]。胰島素水平和IGF-1 水平的升高可激活Ras 信號途徑，促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致一種生存優(yōu)勢，從而誘發(fā)結(jié)直腸癌的發(fā)生[17]。

脂聯(lián)素是近年發(fā)現(xiàn)的一種主要由白色脂肪組織分泌的重要因子，參與糖代謝和脂肪代謝，能改善胰島素抵抗。Awazawa 等[18]發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可通過IL-6 依賴的方式激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3，上調(diào)肝臟胰島素受體底物2 的表達(dá)，增強(qiáng)胰島素敏感性?，F(xiàn)有研究顯示脂聯(lián)素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用，主要通過以下機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用：首先，它可以通過刺激受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路直接作用于癌細(xì)胞，如AMPK，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K / AKt)。其次，它可以通過調(diào)節(jié)靶部位的胰島素敏感性，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和影響腫瘤血管生成來間接起作用[19-20]。本實驗中通過動物實驗，探討脂聯(lián)素對糖尿病相關(guān)結(jié)直腸癌的影響，分析相關(guān)通路變化，明確脂聯(lián)素對腫瘤抑制的作用靶點和分子機(jī)制。本實驗結(jié)果表明在糖尿病小鼠中，脂聯(lián)素能夠抑制瘤體的生長，對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有一定抑制作用。通過比較有無脂聯(lián)素作用小鼠的血糖濃度、糖尿病相關(guān)標(biāo)志物、炎癥相關(guān)標(biāo)志物、病理變化及腫瘤相關(guān)通路蛋白的變化，提示了脂聯(lián)素能通過降低血糖，上調(diào)糖尿病相關(guān)標(biāo)志物ADPN 濃度和降低Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度，降低炎癥相關(guān)標(biāo)志物TNF-α、IL-6、IL-1β濃度，下調(diào)腫瘤相關(guān)通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、βcatenin、PPAR γ 及PAK-1 的表達(dá)從而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究表明脂聯(lián)素能抑制糖尿病相關(guān)結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移，主要機(jī)制可能與降低Leptin、IGF-1、Insulin 濃度以改善胰島素抵抗，降低血糖，降低炎癥相關(guān)標(biāo)志物TNF-α、IL-6、IL-1β 的濃度，下調(diào)腫瘤相關(guān)通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPAR γ及PAK-1 的表達(dá)有關(guān)。