王麗君 包貝貝 郭君平 華燕吟

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是眾多心腦血管疾病的共同病理生理基礎[1]，而血管內(nèi)皮細胞損傷是AS發(fā)生的重要原因[2]。研究表明，細胞自噬在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和血管內(nèi)皮功能方面至關重要[3]。正常的細胞自噬可以通過減輕炎癥水平、影響內(nèi)皮一氧化氮合酶等途徑來保護血管內(nèi)皮細胞，維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[4]；但細胞自噬受損或過度時可導致細胞功能障礙，促進AS 的發(fā)生和進展[5]。目前細胞自噬作為AS 潛在治療靶點受到越來越多的關注。在之前的研究中，本團隊發(fā)現(xiàn)黃連素（berberine，BBR）能通過c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）起保護作用[6]。由于JNK 信號通路與細胞自噬關系十分密切[7]，而異常的細胞自噬可能是AS 的啟動因素，因此本研究通過LPS 誘導HUVECs 建立血管內(nèi)皮炎癥損傷模型，觀察BBR 在LPS 誘導的HUVECs 損傷后細胞自噬中的作用，以期為BBR 在抗AS 治療的臨床應用中提供更多的理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 HUVECs 購自上海奧賽爾斯生物技術有限公司；BBR、LPS、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA） 均購自美國Sigma 公司；DMEM/F12、10%FBS 均購自美國Gibco 公司；自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）購自上海漢恒生物科技有限公司；5-溴-2-脫氧尿嘧啶（EdU）試劑盒、RIPA 裂解液、考馬斯藍染色蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術有限公司；兔抗人p62 抗體、兔抗人LC3 抗體及辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔二抗均購自英國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs 的培養(yǎng)、分組和處理 細胞培養(yǎng)：HUVECs 復蘇后用含有5U/ml 肝素、2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml 青霉素、10μg/ml 鏈霉素、50μg/ml 內(nèi)皮細胞生長添加物和10%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，待細胞生長至80%融合度時，用0.25%胰酶（含0.02%乙二胺四乙酸）消化傳代，倒置光學顯微鏡觀察細胞的生長，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后用于實驗。實驗分組和處理：（1）正常對照組（Control組）：不予特殊處理；（2）LPS 組：只給予LPS 20μg/ml；（3）LPS+RAPA 組：以細胞自噬誘導劑RAPA 100nmol/L 預處理30min 后再給予LPS 20μg/ml 刺激；（4）LPS+3-MA組：以細胞自噬抑制劑3-MA 5mmol/L 預處理30min 后再給予LPS 20μg/ml 刺激；（5）LPS+BBR 組：BBR 10μM 預保護培養(yǎng)24h 后再給予LPS 20μg/ml 刺激。Control 組、LPS 組、LPS+RAPA 組和LPS+3-MA 組4 組細胞相互比較，觀察調(diào)控細胞自噬水平對細胞損傷的影響；Control組、LPS 組和LPS+BBR 組3 組細胞相互比較，觀察BBR的保護作用及其對細胞自噬的影響。

1.2.2 細胞活性檢測 采用EdU 染色法。取對數(shù)生長期的HUVECs，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×105/ml，接種于96 孔板并繼續(xù)培養(yǎng)24h，按分組培養(yǎng)處理后，加入終濃度為50μmol/L 的EdU 孵育2h，加入4%多聚甲醛固定液室溫孵育30min，0.5%TritonX-100 室溫孵育20min，每孔加入1×Apollo 反應液100μl 避光孵育30min，最后再加入5mg/L Hoechst33342 染色液避光孵育30min，染色完成后立即在熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU 染色細胞發(fā)綠色熒光，Hoechst33342 染色細胞發(fā)藍色熒光，EdU 陽性細胞率=暗視野中發(fā)綠色熒光細胞數(shù)/發(fā)藍色熒光細胞數(shù)×100%。

1.2.3 觀察細胞自噬流變化 采用熒光顯微鏡觀察法。取對數(shù)生長期的HUVECs，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×105/ml，接種于24 孔板，培養(yǎng)至細胞融合度50%～70%，用mRFP-GFP-LC3 感染24h，再按分組培養(yǎng)處理后，在激光共聚焦熒光顯微鏡下隨機選取多個細胞拍照，包括紅色熒光圖、綠色熒光圖，紅光激發(fā)的斑點為自噬溶酶體，紅光和綠光共同激發(fā)的黃色斑點為自噬體。

1.2.4 自噬相關蛋白p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平檢測 采用Western blot 法。收集不同處理組的細胞，以RIPA 裂解液充分裂解后再提取細胞總蛋白，冰浴30min 裂解混勻，4℃13 000g 離心10min，BCA 法蛋白定量，SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，之后轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1h 后，加入p62、LC3 及GAPDH一抗（1:1000 稀釋）4℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 標記的鼠抗兔抗體孵育1h，TBST 洗膜3 次，ECL化學發(fā)光法檢測蛋白的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組細胞EdU 染色陽性細胞率比較 4 組細胞用含相關藥物的培養(yǎng)基刺激24h 后，EdU 染色陽性細胞率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，發(fā)現(xiàn)與Control 組比較，LPS 組EdU 染色陽性細胞率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+RAPA 組EdU 染色陽性細胞率明顯下降，而LPS+3-MA 組EdU 染色陽性細胞率明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1（插頁）、表1。

圖1 4 組細胞EdU 染色情況（×200）

表1 4 組細胞EdU 染色陽性細胞率比較（%）

2.2 3 組細胞EdU 染色陽性細胞率比較 3 組細胞用含相關藥物的培養(yǎng)基刺激24h 后，EdU 染色陽性細胞率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，與Control 組比較，LPS 組EdU 染色陽性細胞率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與LPS 組相比，LPS+BBR 組Edu 染色陽性細胞率明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2（插頁）、表2。

圖2 3 組細胞EdU 染色情況（×200）

表2 3 組EdU 染色陽性細胞率比較（%）

2.3 3 組細胞自噬流變化結(jié)果 3 組細胞用含相關藥物的培養(yǎng)基刺激24h 后，HUVECs 細胞內(nèi)自噬體（黃色斑點）和自噬溶酶體（單獨紅色點）均增加，而應用BBR后，自噬體（黃色斑點）和自噬溶酶體（單獨紅色點）均減少，見圖3（插頁）。

圖3 自噬雙標腺病毒感染后3 組細胞自噬流變化（×630）

2.4 3 組細胞p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平比較 與Control 組比較，LPS 組p62 蛋白表達水平下調(diào)，LC-Ⅱ/LC-Ⅰ蛋白表達水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而與LPS 組比較，BBR 組p62 蛋白表達上升，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），結(jié)果見圖4、表3。

圖4 3 組細胞p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達電泳圖

表3 3 組細胞p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平比較

3 討論

自噬是真核細胞中高度保守的代謝活動，廣泛參與多種生理和病理過程[8]。細胞自噬可以被缺血缺氧、饑餓和DNA 受損等多種因素激活，通過形成雙層膜囊泡來隔離受損的細胞器或蛋白質(zhì)，并通過溶酶體結(jié)合來降解內(nèi)容物，分解后為饑餓或代謝壓力狀態(tài)下的細胞提供能量，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和平衡[9]。正磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號傳導通路是自噬過程中最主要的信號傳導通路之一。RAPA 是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，也是哺乳動物mTOR 信號通路特異性的負性調(diào)控因子，能通過與mTORC1 復合物特異性的結(jié)合，促進細胞自噬的發(fā)生，因此RAPA 通常作為細胞自噬誘導劑使用[10]。3-MA 則是PI3K 信號通路的特異性抑制劑，可特異性阻斷細胞自噬過程中自噬泡與溶酶體的融合，通常作為細胞自噬抑制劑使用[11]。在本研究中，加用RAPA 后，與單純LPS組相比，誘導自噬后使細胞活力進一步下降，而加用3-MA 后，減輕自噬后細胞活力明顯提升，說明細胞自噬在LPS 誘導HUVECs 損傷中發(fā)揮重要的作用。

為進一步觀察LPS 誘導HUVECs 損傷后自噬的變化及BBR 的干預作用，本研究采用mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬體系來觀察自噬流的變化。mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染細胞后，LC3 蛋白被RFP 的紅色熒光和GFP 的綠色熒光標記。當自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，由于溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境，導致GFP 綠色熒光淬滅，因此單純紅色熒光點（GFP-RFP+）為自噬溶酶體，而紅色熒光和綠色熒光融合后的形成的黃色熒光點（GFP+RFP+）即為自噬小體，通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光點和黃色熒光點數(shù)量的變化及相互對比檢測即可清晰地看出自噬流的強弱及通暢與否[12]。在本研究中，LPS 作用后HUVECs 內(nèi)黃色熒光點（主要是自噬小體）和紅色熒光點（自噬溶酶體）都增加，而加用BBR 預處理后，黃色熒光點和紅色熒光點減少，提示BBR 可能通過抑制自噬對LPS 誘導HUVECs 損傷起保護作用。BBR 是一味傳統(tǒng)中藥，主要用于胃腸道感染；近年來，多項基礎研究表明BBR 具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化應激、抗炎等多種藥理作用[13]，本研究結(jié)果也進一步證實BBR 在AS 的治療上具有潛在的應用價值。

LC3 和p62 都是自噬標志性蛋白。自噬過程中，LC3蛋白首先形成胞漿型LC3（LC3-Ⅰ），其后LC3-Ⅰ會酶解掉一小段多肽并和膜磷脂相互作用產(chǎn)生LC3-Ⅱ，靶向結(jié)合在細胞內(nèi)自噬體的膜上[14]，其含量與自噬泡數(shù)量呈正相關，因此是自噬過程可靠的標志物，通常用LC3Ⅱ總表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小兩個指標來估計自噬水平的高低[15]。而p62 蛋白作為自噬的選擇性底物，在自噬中晚期可進入自噬溶酶體后被降解，其表達與自噬水平呈負相關[16]。在本研究中，LPS 作用HUVECs后，p62 蛋白表達下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，而加用BBR 干預后，p62 蛋白表達增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值減少，進一步確定BBR 通過抑制過度細胞自噬保護LPS 誘導HUVECs 損傷。但由于細胞自噬的調(diào)控過程非常復雜，牽涉到PI3K/mTOR、JNK、AMPK 等多條信號通路，本實驗僅是初步證實BBR 可以通過抑制過度自噬對LPS 誘導HUVCs 起保護作用，后續(xù)可進一步應用JNK 的特異性抑制劑如SP600125 等進行干預研究，具體自噬的詳細過程及可能的機制也有待進一步去研究。

綜上所述，本研究初步證實BBR 能通過抑制HUVEcs 的過度自噬對LPS 誘導的HUVECs 損傷起保護作用，為臨床上將BBR 作用于內(nèi)皮細胞損傷相關性疾病和AS 的防治提供理論依據(jù)和實驗基礎。