梁軍， 賈玉鑫， 宮凡淇， 祝光濤

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,馬鈴薯科學(xué)研究院，云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬的一年生草本植物，在全世界內(nèi)廣泛種植.在我國糧食結(jié)構(gòu)中，馬鈴薯是繼小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物[1].在馬鈴薯生長發(fā)育過程中，由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病(Late blight)嚴(yán)重影響馬鈴薯的生長和結(jié)薯.19世紀(jì)中期，由于歐洲地區(qū)晚疫病的大面積爆發(fā)，導(dǎo)致了愛爾蘭大饑荒，至少100萬人死亡[2].2009年，這種毀滅性的疾病導(dǎo)致了馬鈴薯全球產(chǎn)量降低了16%，對(duì)全球糧食安全造成了重大的威脅[3].因此研究馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉侵染的分子機(jī)制對(duì)于防治晚疫病、保障我國乃至世界的糧食安全具有重要意義.

在演化過程中，植物與病原菌進(jìn)行著長期且持續(xù)的共進(jìn)化斗爭(zhēng).植物防御過程中的第一道防線，稱為病原相關(guān)分子模式引發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity，PTI).植物通過細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)，識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白FLG22，通過MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]，啟動(dòng)植物的第一道防御機(jī)制.FLG22鞭毛蛋白是微生物表面的一類高度保守的蛋白，在N端含有22個(gè)保守的氨基酸[5].在植物中，鞭毛蛋白受體(Flagellin sensitive 2，F(xiàn)LS2)被證明能夠識(shí)別FLG22，進(jìn)而起始PTI類型的免疫應(yīng)答[6].植物通過激活MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)途徑，提高活性氧水平，啟動(dòng)水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑，關(guān)閉氣孔，促細(xì)胞壁增厚等多種應(yīng)答方式，提高自身對(duì)病原菌侵染的抵抗能力[7].病原菌為了能夠進(jìn)一步侵染植株，會(huì)向植物細(xì)胞內(nèi)分泌效應(yīng)子(Effector)，抑制植物的PTI反應(yīng)，減弱植物的抗病性，增強(qiáng)自身侵染能力[8].RxLR效應(yīng)子對(duì)晚疫病的侵染具有重要貢獻(xiàn)，主要特征是N端含有一個(gè)15-25個(gè)疏水性氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，信號(hào)肽后是保守的Arg-x-Leu-Arg(RxLR)結(jié)構(gòu)域，除此之外還含有多樣且快速進(jìn)化的C末端結(jié)構(gòu)域[9].

在植物和病原菌共進(jìn)化的過程中，植物進(jìn)化出了第二道防線，稱為效應(yīng)子引發(fā)的免疫反應(yīng)(Effector-triggered immunity，ETI).在與晚疫病的長期斗爭(zhēng)中，植物進(jìn)化出了含有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding domain，NB)和富含亮氨酸重復(fù)單元結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat，LRR)的蛋白[10]，稱為NB-LRR類R(Resistance)蛋白，通過直接或間接的方式識(shí)別RxLR型效應(yīng)子，進(jìn)而觸發(fā)ETI，形成強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，引起局部性的細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)，這種反應(yīng)也被稱為過敏反應(yīng)(Hypersensitive response，HR)[11].過敏反應(yīng)是植物防衛(wèi)反應(yīng)的一種重要形式，在病原菌侵染的位置迅速導(dǎo)致一部分細(xì)胞壞死，阻止病原菌的進(jìn)一步侵染[12].因此，分析致病疫霉侵染馬鈴薯時(shí)的效應(yīng)子的表達(dá)情況并鑒定其中的保守效應(yīng)子對(duì)于研究馬鈴薯抵御病原菌侵染的分子機(jī)制具有重要意義.

近年來，高通量測(cè)序技術(shù)在生物學(xué)研究上的應(yīng)用越來越廣泛，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)是利用高通量測(cè)序技術(shù)，將生物細(xì)胞或某個(gè)組織在特定時(shí)期表達(dá)的mRNA、sRNA以及非編碼RNA(ncRNA)進(jìn)行全部測(cè)序分析，從而快速而全面的獲取該物種在特定時(shí)期的所有轉(zhuǎn)錄信息.得到轉(zhuǎn)錄組信息后可以進(jìn)行基因表達(dá)水平分析、差異表達(dá)基因分析、差異表達(dá)基因GO分類以及差異表達(dá)基因聚類分析等，為后續(xù)的研究提供大量的基因信息，作為研究的參考和依據(jù).本研究通過對(duì)4種致病疫霉生理小種侵染的馬鈴薯葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定得到277個(gè)保守的RxLR型效應(yīng)子.此外，通過分析馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉侵染的差異表達(dá)基因，初步表明馬鈴薯對(duì)不同生理小種侵染的響應(yīng)機(jī)制存在很大差異.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用的馬鈴薯品種為Desiree，保存于云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院.材料種植于云南師范大學(xué)馬鈴薯育種試驗(yàn)基地.

采用的致病疫霉生理小種由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院唐唯老師惠贈(zèng)，分別采集于云南不同地區(qū)，編號(hào)為：124、SI、H6和88.保存于云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RNAprep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒(DP441)購自北京天根生化科技有限公司.黑麥培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行了改進(jìn)：60 g黑麥，加水煮沸2 h，用紗布過濾收集黑麥汁，加入20 g蔗糖，100 mL V8蔬菜汁，1 g CaCO3，13 g瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH至7.0，定容為1 L.高溫高壓滅菌后將培養(yǎng)基傾倒于直徑9 cm的塑料培養(yǎng)皿中，用于培養(yǎng)致病疫霉.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 游動(dòng)孢子收集

挑取致病疫霉的菌絲接種到新配制的黑麥培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中，18 ℃黑暗培養(yǎng)14 d，選取菌絲生長旺盛，狀態(tài)良好的平板，加入適量無菌水，使用涂布棒輕輕地將孢子囊刮下來，收集孢子囊.在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子囊數(shù)目，調(diào)整孢子囊濃度約為1 × 105個(gè)/mL，4 ℃靜置2～3 h，使孢子囊破裂，釋放出游動(dòng)孢子，用于接種在馬鈴薯葉片上.

1.3.2 離體葉片接菌實(shí)驗(yàn)

選取長勢(shì)健康且無機(jī)械損傷的Desiree葉片進(jìn)行離體接菌實(shí)驗(yàn).吸取10 μL游動(dòng)孢子懸浮液，接種于葉片背面，采用塑料薄膜封口，保持溫度為20 ℃，相對(duì)濕度為90%以上.接種48 h后，用打孔器取下病斑位置的葉片，立即液氮速凍保存，隨后用于提取RNA.

1.3.3 RNA提取

按照RNAprep Pure Plant Kit試劑盒說明書提取RNA，分別提取未接菌時(shí)的Desiree葉片和接菌48 h后的病斑位置葉片RNA，每個(gè)處理組和對(duì)照組各兩個(gè)重復(fù).將提取得到的RNA送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

采用illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)對(duì)RNA樣品中的mRNA進(jìn)行建庫測(cè)序.采用雙端測(cè)序，讀長150 bp，每個(gè)樣品過濾后得到的有效數(shù)據(jù)不少于8 Gb.

使用Hisat2(v2.1.0)將測(cè)序得到的結(jié)果分別比對(duì)到馬鈴薯和致病疫霉的參考基因組上[14].使用StringTie(v1.3.3b)計(jì)算每個(gè)基因的FPKM[15].使用ballgown(v2.16.0)計(jì)算病原菌處理前后基因表達(dá)水平差異[16]，以上這些軟件均使用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行.使用課題組編寫的Python腳本為基因添加注釋信息，用于后續(xù)的分析.使用Venny(v2.1)繪制基因表達(dá)的韋恩圖(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/).使用ComplexHeatmap(v2.0.0)繪制基因表達(dá)的熱圖[17].

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯葉片離體接菌

選取生長14 d的124、SI、88和H6致病疫霉，采用上述方法收集病原菌孢子囊，顯微鏡下觀察如圖所示(圖1 A).4 ℃靜置2～3 h后，釋放出游動(dòng)孢子.采集Desiree材料生長狀況良好的葉片，放置于托盤內(nèi)，吸取10 μL游動(dòng)孢子接種到馬鈴薯葉片背面，使用塑料薄膜封口，48 h后產(chǎn)生明顯的發(fā)病癥狀(圖1 B和C).使用直徑6 mm的打孔器取下病斑部位的葉片，進(jìn)行RNA的提取.將提取獲得的RNA交予測(cè)序公司進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄組建庫測(cè)序.

A：從培養(yǎng)皿上收集的致病疫霉孢子囊;B：接菌前的Desiree葉片;C：接菌48 h后Desiree葉片的表型

圖1致病疫霉侵染前后Desiree葉片的表型

Fig.1The phenotypes of Desiree leaves before and after inoculation

2.2 致病疫霉侵染的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析

2.2.1 致病疫霉轉(zhuǎn)錄組分析和保守RxLR效應(yīng)子鑒定

使用Hisat2分別將124、SI、88、H6侵染48 h的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)回致病疫霉的參考基因組，獲得reads在基因組上的比對(duì)信息.使用StringTie計(jì)算基因的FPKM，計(jì)算2個(gè)重復(fù)樣品的平均FPKM作為轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量.使用課題組編寫的Python腳本為轉(zhuǎn)錄本添加注釋信息.

根據(jù)基因注釋信息和表達(dá)量，挑選注釋為RxLR且FPKM > 1的轉(zhuǎn)錄本作為在侵染過程中有表達(dá)的效應(yīng)子.共鑒定到427個(gè)效應(yīng)子在致病疫霉侵染過程中有表達(dá)，表明這些蛋白參與了抑制植物免疫反應(yīng)的過程.其中124、88、SI和H6中分別有346，330，357和356個(gè)RxLR效應(yīng)子表達(dá).進(jìn)一步分析表明，287個(gè)效應(yīng)子在88和124中共有表達(dá)，88和H6共有的為298個(gè)，H6和SI共有的為316個(gè)，124和SI共有的為312個(gè).在所有4種生理小種中共同表達(dá)的效應(yīng)子為277個(gè)(圖2 A).這個(gè)結(jié)果說明，在不同的生理小種侵染馬鈴薯葉片時(shí)，會(huì)分泌大量不同的RxLR效應(yīng)子進(jìn)入植物細(xì)胞，從側(cè)面證實(shí)了致病疫霉生理小種的多樣性.這其中277個(gè)效應(yīng)子在4個(gè)小種中均表達(dá)，意味著這些效應(yīng)子在抑制植物免疫反應(yīng)時(shí)具有比較保守的功能.

A：侵染48 h后，不同生理小種中效應(yīng)子表達(dá)情況;B：不同生理小種保守效應(yīng)子的表達(dá)水平

圖2不同致病疫霉生理小種中RxRL效應(yīng)子的表達(dá)情況

Fig.2The expression of RxLR effectors in differentPhytophthorainfestansisolates

2.2.2 晚疫病菌RxLR型效應(yīng)子表達(dá)水平分析

為了進(jìn)一步分析保守效應(yīng)子的表達(dá)水平，比較了277個(gè)保守效應(yīng)子在不同病原菌中的表達(dá)量數(shù)據(jù).使用ComplexHeatmap繪制基因表達(dá)的熱圖.結(jié)果顯示(圖2 B)，在4種生理小種中，共表達(dá)的效應(yīng)子有著類似的表達(dá)模式：部分效應(yīng)子在4種生理小種中表達(dá)量普遍較高(FPKM > 40)，而另一部分效應(yīng)子在4種生理小種中表達(dá)量普遍偏低(FPKM < 10).這種不同生理小種基本一致的表達(dá)模式也進(jìn)一步證實(shí)了這些效應(yīng)子可能具有比較保守的生物學(xué)功能.

2.2.3 馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉侵染的差異表達(dá)基因分析

使用Hisat2將病原菌侵染前后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果比對(duì)回馬鈴薯參考基因組，使用StringTie計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的FPKM作為轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量，使用ballgown計(jì)算病原菌侵染前后的差異表達(dá)基因.挑選fold change≥2，P<0.05的基因作為響應(yīng)病原菌侵染表達(dá)發(fā)生上調(diào)的基因；挑選fold change≤0.5，P<0.05的基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)基因.分別將124、SI、88和H6侵染后表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因繪制韋恩圖.

結(jié)果顯示，4種生理小種侵染馬鈴薯48 h后，共有2 230個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，2 556個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖3).其中88和124侵染馬鈴薯葉片時(shí)，共同上調(diào)表達(dá)的基因有49個(gè)，共同下調(diào)表達(dá)的基因有70個(gè)；124和H6侵染馬鈴薯葉片時(shí)，有27個(gè)基因表達(dá)水平同時(shí)上調(diào)，22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；H6和SI侵染馬鈴薯葉片時(shí)，共同響應(yīng)的基因有29個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的19個(gè)，下調(diào)表達(dá)的10個(gè)；SI和88侵染馬鈴薯葉片時(shí)，4個(gè)基因的表達(dá)同時(shí)上調(diào)，2個(gè)基因的表達(dá)下調(diào).這些結(jié)果表明，只有少數(shù)基因能同時(shí)響應(yīng)2種生理小種的侵染，沒有基因能同時(shí)響應(yīng)4種生理小種的侵染；說明馬鈴薯在感受到不同病原菌侵染時(shí)，相應(yīng)地調(diào)整了自身基因表達(dá)，進(jìn)一步證明致病疫霉不同生理小種之間具有不同的侵染特性.

A：馬鈴薯響應(yīng)病原菌侵染上調(diào)表達(dá)的基因；B：馬鈴薯響應(yīng)病原菌侵染下調(diào)表達(dá)的基因

圖3馬鈴薯中響應(yīng)致病疫霉侵染的差異表達(dá)基因

Fig.3Differentially expressed genes in potato in response toPhytophthorainfestansinfection

3 討 論

作為一種重要的塊莖類糧食作物，世界上約13億人以馬鈴薯作為主糧.威脅馬鈴薯生產(chǎn)最重要的病害之一是由致病疫霉所引起的馬鈴薯晚疫病.即使在近年，晚疫病依然嚴(yán)重威脅馬鈴薯的生產(chǎn)，2012年，甘肅省馬鈴薯晚疫病的爆發(fā)致使部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)絕收，大部分產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重減產(chǎn)[18].

在晚疫病抗性研究中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列抗病基因(R基因).然而隨著晚疫病菌的快速進(jìn)化，含有R基因的品種很快被克服.近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)植物體內(nèi)的感病基因(S基因)進(jìn)行編輯，能夠使植物獲得對(duì)病原菌的廣譜抗性.Wang等[19]發(fā)現(xiàn)致病疫霉效應(yīng)子Pi04089能夠與馬鈴薯細(xì)胞中的RNA結(jié)合蛋白StKRBP1相互作用，將StKRBP1過表達(dá)能顯著降低馬鈴薯的抗病性.相反對(duì)StKRBP1進(jìn)行突變，阻斷其與Pi04089的互作后，顯著增強(qiáng)了馬鈴薯的抗病性.Boevink等[20]發(fā)現(xiàn)致病疫霉效應(yīng)子Pi04314與宿主體內(nèi)的PP1c互作，沉默PP1c基因后，馬鈴薯的抗病性顯著增強(qiáng).表明PP1c作為一種S基因，抑制了植物的免疫反應(yīng).鑒定S基因的第一步就是要獲得致病疫霉中保守的效應(yīng)子.2009年，致病疫霉參考基因組[21]的公布大大加快了這一進(jìn)程.Brian等[21]研究發(fā)現(xiàn)，79個(gè)RxLR效應(yīng)子在致病疫霉侵染馬鈴薯2～3 d后表達(dá)量顯著增高.Yin等[22]對(duì)5種致病疫霉菌株游動(dòng)孢子侵染馬鈴薯葉片12 h后的材料進(jìn)行了深度測(cè)序，共分析得到了245個(gè)RxLR效應(yīng)子，其中108個(gè)在所有5種致病疫霉菌株都有表達(dá)，進(jìn)行序列多態(tài)性分析后，得到了18個(gè)序列保守的RxLR效應(yīng)子，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SF12、SFI3和SFI4在所有被測(cè)菌株中高表達(dá)，表明它們?cè)谇秩局参锏脑缙陔A段具有潛在的重要功能.

研究通過高通量測(cè)序技術(shù)，分析了4種致病疫霉生理小種侵染后的馬鈴薯葉片轉(zhuǎn)錄組，共鑒定到427個(gè)RxLR效應(yīng)子在病原菌侵染過程中表達(dá)，其中277個(gè)效應(yīng)子在4個(gè)生理小種中均有表達(dá)(圖2 A).對(duì)這些效應(yīng)子的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，表明其在不同生理小種中具有類似的表達(dá)模式(圖2 B).這個(gè)結(jié)果為進(jìn)一步尋找馬鈴薯中的保守S基因奠定了基礎(chǔ).此外，還進(jìn)一步分析了馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉侵染的差異表基因.共鑒定到2 230個(gè)基因在病原菌侵染時(shí)表達(dá)上調(diào)，2 556個(gè)基因表達(dá)下調(diào).通過相互比較，發(fā)現(xiàn)不同生理小種所誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因存在很大不同(圖3)，表明不同生理小種具有不同的侵染特性，使得馬鈴薯在應(yīng)對(duì)病原菌侵染時(shí)表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)模式，這也從側(cè)面說明了致病疫霉生理小種的多樣性以及研究馬鈴薯抵御致病疫霉侵染的復(fù)雜性和困難性.