劉 冬，胡九龍，李坤緣，李 萍，劉 梟，高智謀*

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林與服裝學(xué)院，安徽安慶 246003；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，安徽合肥 230036)

0 引言

大豆疫霉是大豆上的毀滅性病害，該病害為土傳病害較難防治；目前由大豆疫霉引起的大豆疫病在我國多個省份均有報道，如黑龍江省、安徽省和福建省[1].大豆疫霉的侵染導(dǎo)致大豆大幅減產(chǎn)，給糧食安全造成較大的威脅并成為研究熱點[2].研究人員在大豆疫霉與大豆互作及其有效防治等方面做了較多的研究工作[3-6].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)團隊在大豆疫霉與大豆的互作研究中做出了重要貢獻，他們以轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等組學(xué)技術(shù)挖掘了大量的可能參與大豆疫霉侵染的致病基因以及可能抑制大豆防衛(wèi)反應(yīng)的效應(yīng)分子[7-8].該團隊進一步通過基因沉默技術(shù)和基因編輯技術(shù)證實了一些基因如PsYKT6等會通過影響疫霉生長速率、產(chǎn)生孢子囊的數(shù)量和游動孢子的釋放等調(diào)控大豆疫霉的侵染盡而影響致病力[8].另外，通過pull-down和酵母雙雜技術(shù)鑒定出可能與大豆互作的一些蛋白，這些蛋白主要屬于RXLR家族[9].在350多個RXLR效應(yīng)分子中約75%的會抑制蛋白Bax引起的植物防衛(wèi)反應(yīng)，如Avh331抑制MAPK介導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)協(xié)助大豆疫霉的侵染活動[10].作為土傳病害大豆疫病的有效防治挑戰(zhàn)巨大，加之我國正在推進《到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動方案》，大豆疫霉的綠色防控成為研究熱點之一.研究人員從植物中提取有效成分，如精油、多酚和酸物類質(zhì)用于疫霉引起病害的防治[11-13].野菊花精油對煙草疫霉引起的病害具有良好的防治效果[11].Liu等人[12]發(fā)現(xiàn)抗氧化劑沒食子酸丙酯可以通過干擾脂肪酸代謝途徑抑制大豆疫霉的生長和侵染，其抑制率為50%的濃度(EC50)為97.2 mg/L.Piotrowski等人[13]從禾本科植物分離到“poacic acid”可以通過阻礙大豆疫霉細(xì)胞壁的形成抑制大豆疫霉，其EC50值為111 mg/L.本研究從大豆根莖及土壤中分離了5株病原真菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對其鑒定，并初步探索了它們致病力存在差異的機制.

1 材料和方法

1.1 驗材料與儀器

主要試驗材料有V8果汁(深圳市歐美匯貿(mào)易有限公司)、氨芐青霉素(Thermo Scientific)、利福平(Thermo Scientific)、2× Taq Plus PCR MasterMix (TAKARA)等.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、引物及測序服務(wù)均有南京擎科生物科技有限公司提供.大豆疫霉模式菌株p6497由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超教授饋贈.試驗主要儀器包括生物安全柜(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、正置熒光顯微鏡(Nikon)、PCR儀(Bio-Rad Lab)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Lab)、超微量核酸蛋白分析儀(美國寶騰)等.

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆疫霉分離與培養(yǎng) 大豆疫霉菌的分離與培養(yǎng)參考鄭小波教授編著的《疫霉菌及其研究技術(shù)》[14]完成，并將分離的5株菌編為BZ1、BB8、FY8、SZ2和BZ9.在10%V8培養(yǎng)基中加入50 μg/mL氨芐青霉素和20 μg/mL利福平提高分離效率.

1.2.2 大豆疫霉形態(tài)觀察 將分離的大豆疫霉分別接種到10%的固體和液體V8培養(yǎng)基上，觀察固體培養(yǎng)基上的大豆疫霉菌落形態(tài)并測量大豆疫霉的生長速率[15]，即用游標(biāo)卡尺測定培養(yǎng)5天的大豆疫霉菌落直徑，生長速率為菌落直徑與培養(yǎng)天數(shù)的比值.利用軟件SPSS20.0對大豆疫霉菌株生長速率差異情況進行單因素方差分析，其差異性(P<0.05)用最小顯著性差異檢驗進行判定.參考《疫霉菌及其研究技術(shù)》[14]在光照下用無菌水誘導(dǎo)孢子囊形成，低溫游動孢子釋放在誘導(dǎo)的培養(yǎng)皿加入大豆根；在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)，卵孢子、孢子囊和游動孢子的侵染情況.

1.2.3 PCR擴增、DNA片段測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 根據(jù)LIU等人[1]的報道以特異性引物ITS6和ITS8參考其PCR條件進行PCR擴增；膠回收DNA片段鏈接T載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，搖菌24 h測序.測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)BLAST 比對，用軟件MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16].

1.2.4 大豆疫霉致病力測定 取大豆疫霉菌碟接種到大豆葉片上保濕2～3 d.以病斑直徑和相對生物量為指標(biāo)，利用WANG等人[17]報道的方法評價大豆疫霉的致病力差異.以體積比3∶1混合乙醇和冰醋酸，加熱對大豆葉片脫色，褐色部分為大豆疫霉侵染造成的病斑，用游標(biāo)卡尺測定病斑直徑.以qRT-PCR檢測被侵染大豆葉片中大豆疫霉管家基因(Physo1_1108986)和大豆管家基因(EFla)的表達量，它們的比值為相對生物量并用于評價大豆疫霉致病力的強弱.用軟件SPSS20.0對大豆疫霉菌株致病力差異情況進行單因素方差分析，其差異性(P<0.05)用最小顯著性差異檢驗進行判定.

1.2.5 qPCR法測定致病基因的表達 提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并根據(jù)文獻報道的qPCR引物和條件進行致病基因的表達量的測定[18-22]；qRT-PCR體系為25 μL，主要反應(yīng)程序為 95 ℃30 s，39 個循環(huán) (95 ℃5 s, 60 ℃30 s)[5].以上定量試驗重復(fù)3次，設(shè)3個技術(shù)平行.

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆疫霉的形態(tài)特征

5株大豆疫霉在10%V8培養(yǎng)基上能較好的生長，菌落呈現(xiàn)白色絨毛狀松散，它們的菌落形態(tài)與大豆疫霉模式菌株P(guān)6497相近(圖1).5株大豆疫霉形態(tài)特征基本一致，如圖2所示菌絲較直向外延伸生長，菌絲無隔膜頂端呈橢圓狀均能產(chǎn)生孢子囊和卵孢子，孢子囊低溫誘導(dǎo)釋放游動孢子，它們趨向性侵染大豆根部.

圖1 大豆疫霉菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Phytophthora sojae圖2 大豆疫霉形態(tài)特征Fig.2 Morphology characteristics of Phytophthora sojae

2.2 引物ITS6和 ITS8擴增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹

用特異性引物ITS6和 ITS8進行PCR擴增大豆疫霉基因組DNA的保守序列區(qū)域，獲得大小為288bp的DNA片段.經(jīng)測序比對與大豆疫霉菌株MT367711.1、MT367710.1、MT367709.1和MT355402.1的保守序列同源性為100%(圖3)；結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為大豆疫霉[14].

圖3 五株大豆疫霉的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic trees of five strains of Phytophthora sojae

2.3 五株大豆疫霉生長速率比較

如圖4所示5株大豆疫霉生長速率存在差異，大豆疫霉FY8的生長速率與模式菌株P(guān)6497基本一致，而菌株BB8和BZ1的生長速率顯著大于它們，生長速率大于12 mm/d.不同的是與模式菌株P(guān)6497相比，SZ2和BZ9的生長速率顯著較慢，其生長速率分別為7.2 mm/d和6.1 mm/d.

2.4 五株大豆疫霉致病力分析

如圖5A所示5株大豆疫霉生在大豆葉片上造成的病斑大小明顯不同，即表明它們的致病力存在差異.與模式菌株P(guān)6497的致病力相比(圖5B)，可將它們的致病力劃分為“強”、“中”和“弱”三個等級，菌株BB8和BZ1的致病力顯著(p<0.01)高于菌株P(guān)6497，F(xiàn)Y8的致病力與其相當(dāng)，而菌株SZ2和BZ9的致病力較弱顯著低于(p<0.01)模式菌株P(guān)6497.這一現(xiàn)象可能與它們的生長速率相關(guān)，在有關(guān)文獻報道中也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象.另外，大豆疫霉和被侵染大豆葉片的相對生物量結(jié)果(圖5C)進一步證實了上述推測；即生長速率較快的大豆疫霉在被侵染的大豆葉片中相對生物量高，造成的葉片病斑大.此外，大豆疫霉的致病力從微觀角度上與它和大豆的互作機制緊密相關(guān)[9-10]；如大豆疫霉致病基因的表達以及其分泌的效應(yīng)分子壓制大豆疫霉的防衛(wèi)反應(yīng)等等[3,15].

圖4 不同菌株大豆疫霉的生長速率 Fig.4 Growth rates of different strains of Phytophthora sojae注:分別表示與模式菌株p6497相比,生長速率在(p<0.05;p<0.01)下有差異,下同.圖5 不同菌株大豆疫霉的致病力Fig.5 Pathogenicity of different strains of Phytophthora sojae

2.5 大豆疫霉致病基因的表達

為進一步探討5株大豆疫霉致病力存在差異的原因，我們對文獻報道的10個大豆疫霉致病基因[17-22]的表達量進行了檢測，結(jié)果如圖6所示.與大豆疫霉致病力相關(guān)的基因PsAAT3、PsFRD、PsDHB、PsDHA、PsGcn5、PsCHS1、PsIMPA1、PsMPK1和PsYKT6在強致病力組菌株BB8和BZ1中的相對表達量>1.0出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達，例如在菌株BB8和BZ1中基因PsDHB的相對表達量分別為4.1和3.1.中等致病力菌株FY8的致病基因的表達量在1.0左右，而在弱致病力組菌株SZ2和BZ9中10個致病基因相對表達量均<1.0.結(jié)果顯示大豆疫霉致病力的差異與致病力基因的表達水平基本呈正相關(guān)性，這樣的推測與文獻報道一致[17-19].WANG等人[17]研究顯示大豆疫霉天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶PsAAT3與氮元利用緊密相關(guān)，該基因在侵染階段上調(diào)表達沉默PsAAT3會降低大豆疫霉的致病力和生長速率.與大豆疫霉能量代謝的一些基因如延胡索酸還原酶編碼基因PsFRD、琥珀酸脫氫酶編碼基因PsDHB和PsDHA與大豆疫霉的生長和致病力相關(guān)它們下調(diào)表達會影響大豆疫霉的生長和侵染過程[5,18].王源超教授課題報道組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因PsGcn5、絲裂原活化蛋白激酶編碼基因PsMPK1和G蛋白家族基因PsYKT6均不同程度的參與了大豆疫霉的生長和侵染調(diào)控過程，對大豆疫霉的致病力有著明顯的影響[19,22].PsCHS1參與疫霉細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成酶的翻譯，在大豆疫霉的侵染過程中發(fā)揮著重要作用，其表達量與致病力成正相關(guān)關(guān)系[20].大豆疫霉鋅指轉(zhuǎn)錄因子PsCZF1參與調(diào)控大豆疫霉生活史的多個階段，例如生長、卵孢子形成、游動孢子釋放和休止孢萌發(fā).該基因正常表達對大豆疫霉的侵染是十分必要的[15].

圖6 不同菌株大豆疫霉致病基因的表達Fig.6 Expression of pathogenic genes in different strains of Phytophthora sojae

3 結(jié)論

本文從被侵染的大豆根莖及土壤中分離了5株病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定它們?yōu)榇蠖挂呙?試驗結(jié)果顯示5株大豆疫霉菌的生長速率和致病力存在差異，其致病力與生長速率和致病基因的表達成正相關(guān)關(guān)系.