張黎冬， 楊中敏， 唐蝶， 楊典， 李曉鳳， 祝光濤

(云南師范大學 生命科學學院,馬鈴薯科學研究院，云南省馬鈴薯生物學重點實驗室，云南省高校馬鈴薯生物學重點實驗室，云南 昆明650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)為茄科茄屬雙子葉一年生植物，適應性強，分布范圍廣，是僅次于小麥和水稻的世界第三大糧食作物，同時它也是全球最重要的塊莖類作物[1].馬鈴薯營養(yǎng)豐富，含有大量的微量元素、蛋白質、氨基酸、B族和C族維生素，具有人類“第二面包”的美譽[2].

光合作用將太陽能轉化為可供綠色植物代謝的碳能，光合產(chǎn)物代謝產(chǎn)生ATP提供其他代謝或者運輸所需的動能[3-4].葉片是最重要的光合作用場所，葉片發(fā)育體現(xiàn)了植物發(fā)育內外部的動態(tài)變化過程[5].葉片(源)產(chǎn)生光合產(chǎn)物供給植物其他組織(庫)的能力是作物產(chǎn)量的主要決定因素[6].此外，馬鈴薯一些與結薯相關的信號分子也在葉中合成，通過莖傳遞到匍匐莖促進馬鈴薯塊莖的形成[3,7].

在馬鈴薯中，葉的光合能力受發(fā)育和環(huán)境控制[1].因而鑒定葉片發(fā)育的基因，對于解析葉片的發(fā)育過程以及合理調控植物的光合能力和產(chǎn)物具有重要的意義.研究以二倍體馬鈴薯為研究材料，構建了一個與葉片發(fā)育相關的分離群體，相較于正常植株，突變植株呈現(xiàn)葉片發(fā)育畸形，硬化變厚，微黃，葉綠素積累不足等表型，同時整個植株明顯變小.研究結合混合群體分離分析(Bulked Segregant Analysis-seq，BSA-seq)以及indel分子標記的篩選，將控制葉片發(fā)育畸形的基因縮小至400 kb的區(qū)間，同時結合基因組信息以及注釋信息篩選出一個候選基因.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CIP 701165(P1)為母本與課題組創(chuàng)制的親和材料E-172(P2)為父本進行雜交獲得F1群體，從F1中挑選單株與P1回交獲得BC1群體，BC1進行自交創(chuàng)制了BC1S1分離群體.BC1S1群體出現(xiàn)了正常葉片以及畸形葉片的分離，該群體則用于后期畸形葉片的遺傳分析和基因定位.

1.2 實驗方法

1.2.1 表型鑒定和混合群體分離分析

播種的二倍體馬鈴薯種子出苗后一個月便可觀察葉片的表型.從后代中挑選葉片正常和畸形的單株各20株，參考劉秀麗等的CTAB法分別提取葉片基因組[8]，晾干后加入含RNase酶的蒸餾水溶解核酸.測定每一份DNA的濃度，將正常葉片與畸形葉片的樣品分別吸取等量的DNA混合，送至北京諾和公司測序.數(shù)據(jù)測量完畢后，首先區(qū)分基因組的兩套單倍型.建立單倍型具體方法：將提取的親本BC1和BC1S1群體提取的DNA深度測序，深度為20×.將親本重測序reads比對到DM參考基因組上，提取雜合SNP位點構成雜合SNP集，再將后代重測序的reads比對到參考基因組,并提取后代每個單株在親本雜合SNP位置的基因型，得到自交后代純合的區(qū)域，利用個體間純合區(qū)域進行延伸，獲得親本的兩套單倍型.

其次，以親本中的任一的一套單倍型作為參考序列，分別計算兩個極端池的基因型頻率并計算SNP-index及其差值Δ(SNP-index)，利用R語言對SNP-index和Δ(SNP-index)畫圖[9].具體操作為：使用bwa軟件將每個個體比對到DM參考基因組上，然后使用samtools比對得到的bam文件排序去重并提取變異位點，使用1 Mb為計算單位,100 kb為滑動窗口分別計算兩池的SNP-index，并計算兩者的差值Δ(SNP-index).利用R語言對SNP-index和Δ(SNP-index)畫圖，橫坐標代表滑動窗口在染色體上的物理位置，縱坐標代表SNP對應的SNP-index和Δ(SNP-index).取全基因組Δ(SNP-index)的最高1%的窗口中的最小限值作為閾值.

1.2.2 DNA 提取以及精細定位

根據(jù)實驗室提取DNA的操作流程，使用八連排和U型板批量提取基因組.具體操作如下：將葉片放入八連排管中.加入鋼珠以及250 μL CTAB溶液，利用細胞破碎儀震蕩破碎組織.65 ℃水浴1 h后冰浴.待樣品溫度涼至室溫，于通風櫥中加入等體積的氯仿抽提.4 000 rpm離心10 min，吸取140 μL上清轉移到0.4 mL U型板中并加入等體積的異丙醇，將樣品板置于 -20 ℃ 冰箱沉淀1 h.4 000 rpm離心10 min，棄上清加入200 μL 75%乙醇洗滌，室溫晾干，加入100 μL含RNase酶的蒸餾水，放入37 ℃培養(yǎng)箱1 h，溶解核酸并消化RNA.

結合混合群體分離分析結果，在初定位區(qū)間設計引物并進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選重組單株以進行候選基因的精細定位.分子標記引物序列如表1，PCR體系為11 μL，5.5 μL Promega Mix混合液，4.1 μL H2O，正反向引物各0.2 μL，1 μL模板，PCR程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，16 ℃保存.聚丙烯酰胺凝膠電泳膠濃度為8%，根據(jù)PCR產(chǎn)物片段大小，跑膠時間為60～90 min.利用銀染法顯色，分析結果并統(tǒng)計重組單株.

1.3 數(shù)據(jù)分析

對于每一對引物所擴增出的PCR產(chǎn)物，以已知表型作為對照，將葉片發(fā)育畸形的記錄為“a”，與之對應的等位基因記錄為“b”，雜合狀態(tài)記錄為“h”.

根據(jù)定位區(qū)間，結合馬鈴薯參考基因組DM的注釋信息，預測葉片發(fā)育畸形基因，并分析相關基因的表達量.

2 結果與分析

2018年春于云南英茂花卉公司實驗基地播種了F1分離群體2 000株.通過表型調查，1 489株植株葉片表型正常，511株植株葉片發(fā)育畸形(圖1A，圖1B).正常與畸形植株葉片的分離比為3∶1(χ2=0.318，P=0.57)，分離比符合孟德爾單基因控制性狀的分離比，表明此分離群體中葉片畸形的基因是由隱性單基因控制.

通過對馬鈴薯葉片發(fā)育正常池以及葉片發(fā)育畸形池進行測序，與馬鈴薯參考基因組DM比對找出SNPs，并計算所有SNP的SNP-index.根據(jù)葉片發(fā)育正常池以及葉片發(fā)育畸形池的SNP-index，計算兩個池的絕對差值Δ(SNP-index).以馬鈴薯染色體為橫坐標，差值為縱坐標作圖(圖1C)，在2號染色體末端出現(xiàn)了兩個明顯的峰值.根據(jù)此區(qū)間的SNP不平衡情況以及該性狀由單基因控制，選擇差值信號位點最大的位置進行后續(xù)的研究.選取Δ(SNP-index)> 0.5，將控制二倍體馬鈴薯葉片發(fā)育畸形的基因初步定位于36.06 Mb～48.24 Mb.

(A)左植株發(fā)育正常，右植株發(fā)育畸形.(B)葉片表型.正常植株正常生長，植株中部葉片呈綠色，葉片形狀為仄形；畸形植株生長速度降低，植株中部葉片泛黃，葉片形狀不規(guī)則，葉片硬化.(C)BSA-seq結果

圖1葉片表型及葉片突變體基因的初定位

Fig.1The phenotype and primary mapping of the abnormal leaf mutant

為了進一步獲得控制馬鈴薯葉片發(fā)育畸形的基因，利用indel-分子標記的方法篩選初步定位區(qū)間的交換單株，以此縮短候選基因所在的區(qū)間.將葉片發(fā)育正常以及畸形池與親本比對，篩選出13對具有多態(tài)性的indel標記 (表1).

表1 精細定位所用的分子標記

圖2葉片發(fā)育基因主效位點的精細定位

Fig.2The fine mapping of major effects gene which regulates leaf development

經(jīng)過混合群體分離分析以及遺傳連鎖分析，將葉片發(fā)育畸形的基因縮小范圍至2號染色體37.630 Mb-38.031 Mb之間,間隔400 kb.結合馬鈴薯參考基因組的注釋信息，此區(qū)間存在36個基因(圖2)，其中在已公布的二倍體馬鈴薯品種DM和RH葉片中均表達的基因有16個(表2).

表2 候選基因表達量分析

在16個候選基因中，核糖體蛋白S15(PGSC0003DMG400007336)是核糖體組裝蛋白[10]；泛素蛋白連接酶(PGSC0003DMG401013630)修飾泛素蛋白，泛素蛋白和植物蛋白的半衰期及定位相關[11]；銅是植物生理活動必不可少的金屬元素[12]，在擬南芥的研究中表明銅轉運體(PGSC0003DMG400013653)作用于根的生長和花粉的發(fā)育[13]；Ctp 合酶(PGSC0003DMG400013634)催化CTP的合成[14]；C端鋅指結構(PGSC0003DMG400013662)與甲基化修飾[15]和誘導細胞分化[16]相關；環(huán)指蛋白113A(PGSC0003DMG400013655)[17]和腺嘌呤糖基化酶(PGSC0003DMG400013631)[18]作用于DNA損傷修復；微染色體維持蛋白(PGSC0003DMG400013633)在真核生物DNA復制起始和延伸階段具有重要作用[19]；轉運蛋白Sec24(PGSC0003DMG401013636，PGSC0003DMG402013636)和其他轉運蛋白結合形成蛋白復合物參與細胞內代謝物的運輸[20]；鈣調素結合蛋白(PGSC0003DMG400013656)發(fā)現(xiàn)于平滑肌中[21]；谷氧還蛋白(PGSC0003DMG400013635)[22]和硫氧還蛋白還原酶(PGSC0003DMG400013638)[23]調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(PGSC0003DMG400013663)[24]可能通過氧化還原作用提高生物量的合成；絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PGSC0003DMG400013661)種類多樣，作用于細胞調控的各個方面[25].

研究中異常植株葉片發(fā)育畸形，顏色泛黃，可能和植物葉綠體發(fā)育相關.排除以上15個候選基因，將三半乳糖基二酰甘油2蛋白基因(PGSC0003DMG400007324，ProteinTRIGALACTOSYLDIACYLGLYCEROL2，TGD2)作為最終候選基因，該基因影響植物質體發(fā)育[26].根據(jù)參考基因組及轉錄組數(shù)據(jù)，該基因在葉片中表達且表達量高于其他組織.

3 討 論

利用圖位克隆的方法篩選出一個控制馬鈴薯葉片發(fā)育的候選基因.從馬鈴薯表型觀察，畸形植株的葉片發(fā)育狀態(tài)不佳，葉片發(fā)黃，形狀不規(guī)則，硬質化嚴重.葉綠體是植株進行光合作用的重要場所.葉綠體的數(shù)量和形態(tài)直接影響葉片的顏色.因此，與葉片葉綠體生物合成和發(fā)育相關的基因表達發(fā)生改變則會導致葉片失去綠色[1,27-28].

利用現(xiàn)有的群體數(shù)量，將控制馬鈴薯葉片發(fā)育的基因縮至范圍為400 kb的區(qū)間.結合參考基因組信息，此區(qū)間內含有36個基因，包含12個未知功能基因.該區(qū)間有一個與質體發(fā)育相關的基因三半乳糖基二酰甘油2 蛋白 (TDG2)，推測其為控制馬鈴薯葉片發(fā)育的候選基因.在模式植物擬南芥中共有四個TDG基因，主要參與脂質從內質網(wǎng)到葉綠體的運輸[26,29].TDG1-TDG4這四個基因中任何一個基因的突變都會導致了三半乳糖基二酰甘油的積累(TGDG)[30].TDG2主要是通過其N端的跨膜結構域錨定在內質網(wǎng)上發(fā)揮功能[31].衣藻TDG2的突變呈現(xiàn)早衰現(xiàn)象，與對照相比TDG2基因被突變的衣藻壽命明顯縮短，培養(yǎng)21天后，葉綠素含量降低，培養(yǎng)物變黃[32].

馬鈴薯葉片發(fā)育良好與否直接關系光合作用能力的強弱從而影響馬鈴薯產(chǎn)量高低.因而能夠構建一個與馬鈴薯葉片發(fā)育相關的群體并且篩選候選基因對馬鈴薯育種具有重要意義.