肖錦新 閆赟 杜麗波 余秀蘭 陳德勝 潘玉杰

[摘要]目的 探討替芬泰（TFT）對2.2.15細胞分泌乙肝表面抗原（HBsAg）的影響。方法 以乙肝病毒的脫氧核糖核酸（HBV-DNA）克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2 2.2.15細胞系作為實驗?zāi)Ｐ?，TFT配制成102、51、25.5 μm的藥液，另設(shè)拉米夫定（LAM）218 μm陽性對照組（簡稱為LAM 218 μm組）和病毒對照組，分別加入24孔細胞培養(yǎng)板中，0.6 ml/孔，每濃度4孔。每4天換液1次，第8天收集細胞上清液。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測細胞上清液中HBsAg的滴度，比較各組3個批次的OD值，并記錄其平均抑制率。結(jié)果 LAM 218 μm組的OD值明顯低于病毒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;TFT 102、51、25.5 μm組的OD值均明顯低于病毒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。LAM 218 μm、TFT 102、51、25.5 μm組的平均抑制率分別為37.49%、56.26%、47.33%、36.82%。結(jié)論 TFT能有效抑制HBsAg分泌，從而發(fā)揮出抗HBV的作用，可為進一步研發(fā)TFT成為抗HBV新藥提供數(shù)據(jù)支持及參考。

[關(guān)鍵詞]替芬泰;2.2.15細胞;乙肝表面抗原

[中圖分類號] R322.47? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）9（c）-0041-03

[Abstract] Objective To explore the effect of Tifentai （TFT） on secretion of Hepatitis B surface antigen （HbsAg） in 2.2.15 cells. Methods Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid （HBV-DNA） clones were used to transfect human hepatoma cells HepG2 2.2.15 cell line as experimental model， and TFT was prepared into 102， 51， 25.5 μm solution. Lamivdine （LAM） 218 μm positive control group （referred to as LAM 218 μm group） and virus control group were established， and they were added to 24-well cell culture plates， 0.6 ml/well， 4 wells per concentration. The solution was changed once every 4 days， and the cell supernatant was collected on the eighth day. The titer of HBsAg in the cell supernatant was determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and the OD values of the three batches in each group were compared， and the average inhibition rate was recorded. Results The OD value of the LAM 218 μm group was significantly lower than that of the virus control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The OD values of the TFT 102， 51， and 25.5 μm group were significantly lower than those of the virus control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The average inhibition rates of the LAM 218 μm， TFT 102， 51， and 25.5 μm group were 37.49%， 56.26%， 47.33%， and 36.82%， respectively. Conclusion TFT can effectively inhibit the secretion of HBsAg， thereby exerting its anti HBV effect， and can provide data support and reference for further research and development of TFT to become a new anti-HBV drug.

[Key words] Tifentai; 2.2.15 cells; Hepatitis B surface antigen

乙肝是一種病死率較高的傳染性疾病，由乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。目前臨床上常用核苷類藥物和干擾素治療乙肝，但這些藥物均存在效果不佳或者較為昂貴等不足[2]。替芬泰（Tifentai，TFT）是一種二肽衍生物，從苗藥馬蹄金中分離出，其獨特的抗病毒機制主要是通過誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)發(fā)揮作用[3-4]。TFT已被證實具有良好的抗HBV的作用，且具有較輕的毒副作用、耐藥性良好等優(yōu)點[5-7]。目前，TFT對HBV影響的相關(guān)報道較少，因此，本研究以HBV-DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2 2.2.15細胞系作為實驗?zāi)Ｐ?，觀察TFT對2.2.15細胞分泌乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）水平的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1藥物、試劑與主要儀器

1.1.1藥物? TFT，純度為99%，貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室合成，批號：20140106;拉米夫定（Lamivdine，LAM），100 mg/片，葛蘭素史克制藥有限公司生產(chǎn)，批號：13030039。

1.1.2 HepG2 2.2.15細胞? 乙肝病毒的脫氧核糖核酸（Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2 2.2.15細胞系，由美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，本臨床藥理研究室自行傳代培養(yǎng)。

1.1.3試劑? DMEM培養(yǎng)液（美國Coring公司，批號：10013630R）;胎牛血清（美國Gibco公司，批號：1527494）;胰蛋白酶（Amresco公司）;EDTA（Amresco公司）;G418（美國Corning公司，批號：30002226）;DMSO（Vetec公司）;0.22 μm無菌濾器（sartorius stedim公司）;HBV表面抗原診斷試劑盒（北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司，批號：201407002）。

1.1.4主要儀器? 二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）;倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;細胞培養(yǎng)瓶（美國Coring公司）;24孔細胞培養(yǎng)板（美國Coring公司）;低溫高速離心機（美國Thermo公司）;電子分析天平（上海天平儀器廠）;生物安全柜（美國Thermo公司）;超低溫冰箱（海爾集團）;BioTek全自動全波長自動酶標(biāo)儀及Bio TeK Instruments全自動酶標(biāo)洗板機（北京海淀區(qū)天石醫(yī)療用品制作所）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)? 選用對數(shù)生長期的2.2.15細胞，用0.02%的EDTA洗兩遍，加入0.25%胰蛋白酶1 ml，靜置消化3～5 min，輕輕吹散細胞成單個狀態(tài)，進行1：1傳代，每瓶加入200 μg的G418，放入5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳代3～4次后可用作實驗。

1.2.2細胞接板? 選用對數(shù)生長期的2.2.15細胞，用0.02% EDTA進行清洗，清晰2次，再加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化3～5 min，吹打均勻后，計數(shù)到2×105個細胞/ml，然后將其接種至24孔細胞培養(yǎng)板中，0.5 ml/孔。放入5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞貼壁后方可進行實驗。

1.2.3分組及給藥? TFT配制成濃度從高到低依次為102、51、25.5 μm的藥液，同時另設(shè)LAM 218 μm陽性對照組（簡稱為LAM 218 μm組）和病毒對照組，分別加入24孔細胞培養(yǎng)板中，0.6 ml/孔，每濃度4孔。每4天換液1次，第8天收集細胞上清液，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測細胞上清液中HBsAg的滴度。實驗分3個批次。

1.3觀察指標(biāo)

通過檢測細胞上清液中HBsAg的滴度，計算藥物抑制HBsAg的抗原百分率（%）、3個批次的平均抑制率，比較各組不同批次的OD值以觀察TFT 102、51、25.5 μm及LAM 218 μm對2.2.15細胞分泌HBsAg水平的影響，并記錄其平均抑制率，計算公式如下：抗原抑制率（%）= ×100%。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

LAM 218 μm組的OD值明顯低于病毒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;TFT 102、51、25.5 μm組的OD值均明顯低于病毒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;LAM 218 μm、TFT 102、51、25.5 μm組的OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。LAM 218 μm、TFT 102、51、25.5 μm組的平均抑制率分別為37.49%、56.26%、47.33%、36.82%（圖1）。

3討論

40多年前，HBsAg已被發(fā)現(xiàn)是一種HBV的外殼蛋白，自身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)往往會伴隨HBV的存在，在患者的陰道分泌物、精液、鼻咽分泌物、淚水、汗液、乳汁、唾液、血液均可檢測到HBsAg，目前已經(jīng)被臨床用作于HBV感染的標(biāo)志[8-9]。血液中的HBsAg濃度水平更能準(zhǔn)確反映機體內(nèi)的真實水平，且樣本獲取方式簡單，準(zhǔn)確度高。臨床上往往通過檢測患者血清中HBsAg的表達水平來鑒定是否感染HBV，HBsAg至今仍是HBV感染的最為明顯標(biāo)志[10]。有研究[11]顯示，血清的HBsAg滴度水平還與HBV傳染性呈正變關(guān)系，但并非肯定的一致關(guān)系，可見，血清HBsAg的滴度水平可作為傳染性的參考指標(biāo)之一，滴度水平越高，說明機體內(nèi)的e抗原（Hepatitis Be antigens，HBeAg）、脫氧核糖核酸聚合酶（deoxyribonucleic acid polymerase，DNAP）、HBV-DNA陽性的概率越大，傳染性也越強。血清中的HBsAg滴度水平與乙型肝炎的嚴(yán)重程度之間沒有必然關(guān)系，主要是由于肝炎的嚴(yán)重程度更多與機體的肝功能有關(guān)，肝功能是體內(nèi)肝細胞損傷程度的影響，同時也與個體的免疫系統(tǒng)的強弱有關(guān)，相同HBsAg滴度水平的攜帶者，可表現(xiàn)為慢性活動性肝炎、也可表現(xiàn)為肝臟纖維化，肝硬化晚期、或者肝癌等。甚至部分肝功能正常且無臨床癥狀體征的患者，體內(nèi)的HBsAg滴度水平很高，而一些重癥肝炎且肝功能嚴(yán)重損害的患者，其體內(nèi)的HBsAg滴度水平卻很低，甚至表現(xiàn)為陰性。但也有研究得出的結(jié)果表明，HBsAg滴度與肝炎的嚴(yán)重程度相關(guān)[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，TFT 102、51、25.5 μm組的OD值均明顯低于病毒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;TFT 102、51、25.5 μm組的平均抑制率分別為56.26%、47.33%、36.82%，呈現(xiàn)出良好的濃度依賴性，提示隨著TFT藥物濃度水平的升高，2.2.15細胞分泌HBsAg的水平越低，高濃度的TFT對2.2.15細胞分泌HBsAg抑制效果越強，且在給藥8 d時抑制效果最強，TFT具有較強的抗HBV活性，可能與TFT的藥物成份有關(guān)。TFT是一種從苗藥馬蹄金中分離而成的二肽衍生物[14]，具有與其他核苷類藥物不同的抗病毒機制，一方面是通過調(diào)控HBV復(fù)制下游Calcium-PyK2信號通路及p21因子，從而發(fā)揮HBx蛋白的功能的影響，進而達到抑制HBV復(fù)制目的;另一方面并可通過影響機體內(nèi)B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、白細胞介素-21（IL-21）等相關(guān)免疫因子，從而發(fā)揮抗HBV作用[15]。本研究僅為細胞實驗，詳細作用機制仍需更多研究來進一步證實。

綜上所述，替芬泰能有效抑制HBsAg分泌，從而發(fā)揮出抗HBV的作用。為進一步研發(fā)替芬泰成為抗HBV 新藥提供數(shù)據(jù)支持及參考。

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（收稿日期：2019-04-04? 本文編輯：任秀蘭）