陳文學 鄒學森 胡文強 王春陽 黃秀珍 周雪春 程為良

鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其主要的死亡原因[1-2]，目前鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移診斷主要依靠頸部淋巴結(jié)影像學檢查。影像學檢查對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷主要依賴淋巴結(jié)形態(tài)改變及與周圍組織器官的關(guān)系。很小的淋巴結(jié)內(nèi)部也有可能發(fā)生早期的微小轉(zhuǎn)移灶，因此單純依靠形態(tài)學診斷無法滿足臨床診斷的需求[3]。分子成像是將分子生物學方法與現(xiàn)代醫(yī)學影像技術(shù)相結(jié)合，無創(chuàng)性探查體內(nèi)生理和病理狀態(tài)下分子和細胞水平的生物過程。MRI空間分辨率高，軟組織對比度好，不受成像組織部位限制，尤其適用于實體瘤和淋巴結(jié)的檢出，但由于常規(guī)造影成像對淋巴結(jié)內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶診斷特異性和敏感性較低，無法滿足臨床診斷隱蔽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的需求。因此本文對傳統(tǒng)造影劑進行改良工藝研究，用聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)包裹造影劑超小順磁氧化鐵(USPIO)形成具有良好降解性和生物相容性的PBCA-USPIO改良造影劑[4]，改造后的造影劑連接具有靶向功能的鼻咽癌特異性適配子探針(AP-PBCA-USPIO)，使造影劑具有靶向性。

1 材料與方法

1.1 試劑

α-氰基丙烯酸正丁酯(α-BCA)購自浙江金鵬化工股份有限公司；右旋糖酐-70購自SIGAMA公司；無水乙醇(分析純)、鹽酸(分析純)、二氯甲烷(分析純)購自鄭州市化學試劑廠，鏈霉親和素購自賽默飛科技有限公司，生物素標記適配子購自上海生工。

1.2 儀器

85-2恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)，JSM-7001F透射電鏡(日本電子公司)，紫外分光光度計(Eppendorf有限公司)，電子分析天平(日本津島)。

1.3 方法

1.3.1 共沉淀法合成USPIO 將FeCl35.74 g和FeSO4·7H2O 2.78 g充分溶解于20 ml蒸餾水中，將液體轉(zhuǎn)入三角燒瓶中置于恒溫磁力攪拌器上，溫度保持60 ℃，攪拌時間10 min，將液體倒入燒杯中置于高磁場下冷卻，可見分層，將上清液倒掉，加入氨水(pH 8.0)反復(fù)洗3遍，加入上述氨水40 ml。月桂酸1 g充分溶解于20 ml水中。

1.3.2 PBCA-USPIO的制備工藝 采用乳化聚合法[5]制備PBCA-USPIO。BCA單體用二氯甲烷稀釋(VCH2CL2∶VBCA=5∶1)，配制KH2PO4-K2HPO4酸性緩沖液20 ml，在溶液中加入表面活性劑緩沖溶液，在溶液中加入表面活性劑右旋糖酐-70，將濃度為20 mg/ml的USPIO滴入混合液中，1 200 rpm攪拌5 min，攪拌同時緩慢滴入稀釋后的BCA單體，持續(xù)乳化聚合一定時間后，用NaOH溶液終止反應(yīng)，減壓抽濾，即得穩(wěn)定的PBCA-USPIO納米混懸液。

1.4 正交設(shè)計優(yōu)化制備條件

在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)溶液的pH值、BCA單體濃度、右旋糖酐-70穩(wěn)定劑濃度是影響納米粒粒徑大小及均勾度的主要因素。應(yīng)用正交表L9(33)進行正交實驗分析，依次設(shè)置三個正交因子A(pH值)、B (BCA單體濃度)、C(右旋糖酐-70濃度)，3個水平優(yōu)化PBCA-USPIO的制備條件，見表1。

表1 各因素水平

注：A為pH值；B為BCA單位濃度；C為右旋糖酐-70濃度。

1.5 制備適配子PBCA-USPIO納米粒子

用NaOH溶液將PBCA-USPIO納米粒子混懸液調(diào)整到pH 9.0并作用1 h，使PBCA表面產(chǎn)生羧基基團，然后將溶液調(diào)整到pH 7.0。加入用PBS溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和鏈霉親和素，PBCA-USPIO：鏈霉親和素：EDC摩爾比為1∶10∶25，4 ℃反應(yīng)12 h，加入生物素化的適配子，孵育10 min，即可得到適配子PBCA-USPIO納米微粒混懸液。適配子PBCA-USPIO納米粒子用透射電鏡進行鑒定。

1.6 適配子PBCA-USPIO納米粒子的T2馳豫率測定

將適配子PBCA-USPIO納米粒子溶液用水稀釋到鐵濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/l，MR掃描連續(xù)測定4個層面T2值，取平均值。T2馳豫率=鐵濃度與1/T2直線方程的斜率。

1.7 適配子PBCA-USPIO細胞毒性測定

取對數(shù)生長期的Hela細胞，按照每孔5000個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種100 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h棄上清，分別加入100 μl用10%胎牛血清的培養(yǎng)基配制成含鐵50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml、1 000 μg/ml適配子PBCA-USPIO和USPIO，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔?？瞻捉M加入100 μl的培養(yǎng)基，樣品對照組加入100 μl納米粒子，正常對照組加入100 μl細胞懸液。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl二甲基亞砜，在平板振蕩器上振蕩10 min，在酶標儀490 nm波長測定吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率[6]=(樣品孔OD值-樣品對照孔OD值)/正常對照孔的OD值。

1.8 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析，PH值、BCA單體濃度、右旋糖酐-70濃度采用正交設(shè)計方差分析。細胞毒性測定用析因設(shè)計方差分析。

2 結(jié)果

2.1 正交設(shè)計及結(jié)果

按L9(33)設(shè)計成3因素3水平的正交實驗，實驗結(jié)果見表2。最優(yōu)方案為A2B2C3，即pH6.0，BCA單體濃度3%，右旋糖酐-70濃度15%。

表2 正交設(shè)計實驗結(jié)果(n=3)

注：A為pH值；B為BCA單位濃度；C為右旋糖酐-70濃度。

2.2 適配子PBCA-USPIO形態(tài)鑒定

最優(yōu)處方制備適配子PBCA-USPIO激光粒度分析儀測定結(jié)果顯示粒子直徑成正態(tài)分布。透射電鏡觀察顯示其形態(tài)為類球形,包殼光整，見明顯的殼核結(jié)構(gòu)，平均粒子直徑為(83±7)nm。

2.3 適配子PBCA-USPIO納米微粒的T2馳豫率

馳豫率是反應(yīng)造影劑在磁共振時對馳豫過程的影響程度。超順磁造影劑馳豫率越大負性強化效果越明顯。從圖1可以看出隨著鐵濃度的增加，T2值逐漸下降，T2的馳豫率為鐵濃度與1/T2直線方程的斜率，因此適配子PBCA-USPIO納米微粒的鐵濃度(mmol/l)與1/T2(1/ms)直線方程為y=0.160x+0.005, T2馳豫率為0.16×106mol-1s-1。

圖1 鐵與T2的回歸曲線

2.4 適配子PBCA-USPIO納米微粒的細胞毒性實驗

MTT法測定細胞在適配子PBCA-USPIO和USPIO作用下的活性見圖2。隨著鐵濃度的增加，Hela細胞存活率逐漸下降，兩組納米顆粒對Hela細胞的毒性有顯著差異，USPIO組細胞毒性明顯強于適配子PBCA-USPIO組(F=3590.08,P<0.05)。通過多重比較分析，兩種納米顆粒隨著濃度的增加毒性增強(P<0.05)。不同濃度的兩種納米顆粒細胞毒性有顯著性差異(F=1318.77,P<0.05)。

圖2 不同鐵濃度Hela細胞的存活率

3 討論

淋巴結(jié)是否累及是腫瘤分期、治療方案、判斷預(yù)后的重要指標。判斷淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移通常依據(jù)CT或MRI的淋巴結(jié)直徑，在確定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直徑界值一直有爭議，有些轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)和正常淋巴結(jié)大小相似。USPIO是比較理想的MRI對比劑，它的MRI增強掃描可以發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)移灶，與淋巴結(jié)是否增大無關(guān)。

PBCA的聚合方法主要有界面聚合法和乳化聚合法，界面聚合法是在攪拌的條件下將油相(含有藥物、有機溶劑等)加入到水相(含有表面活性劑)當中，在油水界面進行陰離子聚合反應(yīng)形成納米粒，蒸發(fā)掉有機溶劑后可得到載藥的納米粒，乳化聚合法是向含有表面活性劑的水相中加入單體，單體和水溶液形成乳液，溶液中的OH-引發(fā)乳液顆粒的聚合進而形成納米微粒，藥物被包裹于納米微粒中。因乳化法操作簡單，適用于水溶性藥物的載體制備，因此本研究采用乳化聚合法，制備的納米微球小于100 nm,與其他研究中制備的微球粒徑相似[7-8]。

Fe是USPIO的主要成分，如果鐵含量增加可以對人體產(chǎn)生毒性作用。因此本研究用HeLa細胞進行細胞毒性實驗，研究不同鐵濃度的適配子PBCA-USPIO和USPIO與HeLa細胞孵育后的細胞存活率。結(jié)果顯示兩組隨著鐵濃度增加，細胞毒性也增加，且呈正相關(guān)關(guān)系，在≥100 μg/ml時同等鐵濃度的情況下，適配子PBCA-USPIO的細胞毒性明顯低于USPIO，鐵濃度在1 000 μg/ml時PBCA-USPIO組HeLa細胞的存活率達到69.5%遠高于USPIO組15.5%。研究顯示用鼠肝細胞與SPIO共孵育24 h，當鐵濃度達到250 μg/ml時，細胞死亡率達到50%，這與本研究數(shù)據(jù)接近[9]。USPIO的細胞毒性大是因為USPIO疏水性大，與細胞膜相互作用強[10]，可以被細胞吞噬，釋放游離鐵導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷，最終使細胞死亡[11]。當PBCA包裹USPIO后，顆粒與細胞的疏水作用減弱，細胞對顆粒的吞噬減少，細胞內(nèi)鐵含量也減少，所以細胞毒性下降。