邱 月 安莉莎 曹小芳 杜 蒙 高 丹 張 辰 王啟迪 馬 旭*

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730)；2.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所

8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)作為一類穩(wěn)定的DNA氧化產(chǎn)物，與多種氧化損傷相關(guān)疾病進程具有相關(guān)性，目前已成為DNA氧化損傷中最常用的生物標志物[1-3]。在臨床上作為一種生物標志物可以輔助相關(guān)疾病的診斷或反映相關(guān)疾病的進程。妊娠期糖尿病(GDM)發(fā)病機制研究表明其與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系[4-5]。因此有研究推斷8-OHdG與GDM的疾病進程可能存在一定的聯(lián)系[6-7]，提示對于8-OHdG水平的監(jiān)控可能對臨床上早期診斷GDM以及制定后續(xù)治療方案有一定的積極作用。本研究嘗試建立具有特異性良好的檢測8-OHdG的方法，用于檢測孕婦血清8-OHdG水平，探討GDM與血清8-OHdG水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料

59份GDM血清樣本和59份健康孕婦血清樣本為人類遺傳資源中心樣本庫提供 (2010年—2015年收集)；Balb/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司；小鼠骨髓瘤細胞系購自北京康為世紀生物科技有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、抗體亞型測定試劑盒均購自Sigma公司；8-OHdG mcKLH購自Thermo Fisher Scientfic公司；其他各類試劑和培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司和Corning公司。

1.2 檢測方法的建立

1.2.1合成抗原8-OHdG-mcKLH本研究使用EDC法將8-OHdG與鑰孔血藍蛋白(mcKLH)偶聯(lián)形成了8-OHdG-KLH復(fù)合物，取2mg的mcKLH溶于2ml ddH2O中 ，形成A溶液；取8-OHdG 5mg 溶于50μl DMSO中，形成B溶液；稱取0.011g EDC溶于1100μl ddH2O中，形成C溶液；取500μl A溶液與B溶液混勻后迅速加入125μl的C溶液，將混合液置于搖床，室溫180rpm 2h；混合液4℃透析2～3h，換2次PBS后過夜；次日將混合液儲存于EP管內(nèi)，標記濃度5mg/ml備用，置-20℃冰箱保存。

1.2.28-OHdG抗體的制備采用8-OHdG-mcKLH免疫原對6只Balb/C小鼠進行腹腔免疫，經(jīng)過4次免疫后，隔7d斷尾采血，第4次加強免疫前取小鼠尾血，間接ELISA法檢測小鼠體內(nèi)8-OHdG抗體。選取效價高的小鼠進行細胞融合實驗。融合后每日觀察，將細胞數(shù)量較多的培養(yǎng)基保存ELISA檢測篩選陽性細胞株，用有限稀釋法將細胞進行克隆，最終得到能夠穩(wěn)定分泌抗8-OHdG的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。小鼠腹水體內(nèi)誘生法制備大量單克隆抗體，硫酸銨鹽析法結(jié)合蛋白質(zhì)A親和層析柱純化法純化腹水抗體。

1.2.3陽性克隆抗體亞型鑒定結(jié)果及腹水效價測定確定1D4、3B8、4G3、5C10、8E9、7D5、8D9的抗體作為腹水生產(chǎn)細胞株，制備腹水小鼠7只，10d后收集腹水，行純化和腹水效價檢測。腹水單克隆抗體的效價以間接ELISA方法測定。其中選擇了抗體效價較高的1D4(1:320000)和3B8(1:400000)抗體。其中1D4的亞型為IgG1 /κ，3B8的亞型為IgG2a/κ。

1.2.4配對抗體的篩選釆用抗體類型及亞類鑒定ELISA試劑盒(Southern Biotech公司)，實驗步驟按照試劑盒說明書操作，對已純化到的抗體進行分型檢測，并以8-OHdG為抗原進行包被，間接ELISA法測定抗體的效價。將鳥嘌呤(G)、鳥苷(GR)、8-羥基鳥苷(8-OHG)、尿素(U)分別作為包被抗原，間接ELISA法對抗體進行交叉反應(yīng)性分析。

1.2.5生物素-親和素ELISA的方法的建立制備3B8生物素化抗體，將2mg/ml的8-OHdG抗體1D4包被，100μl/孔，用碳酸鹽緩沖液包被抗體，4℃孵育過夜；洗板后, 加入封閉液200μl/孔, 室溫封閉2h，洗板晾干；加入樣本(1：1000稀釋)以及8-OHdG標準品100μl/孔加入96孔板, 室溫孵1h；加生物素化抗體3B8(1：40000稀釋), 在洗板后100μl/孔加入96孔板, 室溫孵1h；洗板后加入顯色液100μl/孔, 室溫避光孵育15 min；加入終止液100μl/孔，反應(yīng)30min內(nèi)讀取吸光度值(450nm)。

1.2.6建立標準品通過建立8-OHdG不同濃度之間與OD值的關(guān)系模型，從數(shù)學(xué)關(guān)系模型中選擇線性較好的部分進行R2值的計算，從而縮小8-OHdG濃度檢測范圍并再次檢測直至得到較高的R2值。

1.2.7回收率實驗利用回收率實驗評價方法的精密度與準確度。 取1份由8份血清混合的樣品(市售試劑盒檢測3次平均濃度為9.5ng/ml)分成3等份，分別加入3種不同濃度的8-OHdG抗原標準品(濃度分別為7.5，10，8ng/ml)，檢測其實際濃度(平行檢測3次平均值)，計算回收率。

1.2.8重復(fù)性實驗批內(nèi)實驗：將3份不同濃度(10.3，7.58，4.06ng/ml)的血清樣本(本室測得), 在同一酶標板上檢測6次，檢測得出3種血清濃度樣本的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)。批間實驗：將3份不同濃度(10.3，7.58，4.06ng/ml)的血液樣本(本室測得)在3種不同酶標板上進行檢測，得出3種血清樣本的批間CV。

1.3 樣本檢測

2 結(jié)果

2.1 交叉反應(yīng)

根據(jù)各單抗腹水的亞型鑒定結(jié)果，選擇了1D4與3B8不同亞型的抗體。對8-OHdG及其類似物的進行交叉反應(yīng)。將抗體1D4、3B8對8-OHdG的反應(yīng)率設(shè)定為100%，抗體1D4與8-OHdG類似物鳥嘌呤(G)、鳥苷(GR)、8-羥基鳥苷(8-OHG)、尿素(U)的交叉反應(yīng)率分別為15%、11%、10%和10%，抗體3B8分別為80%、36%、26%和20%。抗體1D4、3B8與尿素的交叉反應(yīng)率分別為10%和20%。

2.2 抗原標準品濃度范圍

如圖1所示，當(dāng)8-OHdG的濃度在1.56～100 ng/ml時，8-OHdG濃度與OD值成線性相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)R2值為0.9947。

圖1 8-OHdG抗原標準曲線

2.3 批內(nèi)批間重復(fù)性實驗

3種血液樣本批內(nèi)CV分別為1.8%，2.4%，6.3%；批間CV分別為9.7%，9.0%，10.1%。批內(nèi)與批間CV均<15%。

2.4 回收率實驗

回收率試驗結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果

2.5 GDM患者及健康孕婦檢測結(jié)果比較

GDM組孕婦8-OHdG血清水平(7.3±1.3)ng/ml，正常對照組(2.2±0.7)ng/ml， 兩組有差異(P<0.001)。

3 討論

本研究通過優(yōu)化后的偶聯(lián)方法，得到了免疫效果較高的8-OHdG-mcKLH 抗原復(fù)合物，隨后進行小鼠免疫，腹水制備，抗體純化等，最終獲得一對8-OHdG的特異性的配對抗體。由于實驗結(jié)果中抗體1D4與鳥嘌呤的交叉反應(yīng)率為15%，而抗體3B8與鳥嘌呤的交叉反應(yīng)率為80%，推測抗體1D4和抗體3B8分別結(jié)合在8-OHdG的不同部位，可以作為配對抗體建立ELISA檢測方法并對8-OHdG進行識別。另外，抗體1D4、3B8與尿素的交叉反應(yīng)率較低，說明尿液中的氨不會對檢測結(jié)果造成較大影響，因此本檢測方法不僅可以用于血液樣本的檢測，也適用于尿液樣本的檢測。此外，該配對抗體也可用于氧化損傷方向的聯(lián)合免疫診斷試劑的開發(fā)，為氧化損傷檢測領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)。

由于每個親和素能結(jié)合4個分子的生物素，通過生物素與親和素之間的放大作用，可以使檢測方法更靈敏[8]。生物素與親和素結(jié)合穩(wěn)定性好、專一性強，不受試劑濃度、 pH環(huán)境或蛋白變性劑等有機溶劑影響，這一特點可以用于構(gòu)建一個多層次信號放大系統(tǒng)[9]。本研究利用單克隆抗體技術(shù)，制備出8-OHdG的特異性抗體后，建立的生物素-親和素標記的雙抗夾心ELISA定量檢測8-OHdG的方法，為研究氧化損傷與疾病關(guān)系提供了更為準確、便捷的檢測方法。

利用建立起來的生物素-親和素雙抗夾心ELISA定量檢測8-OHdG方法，對59份GDM患者及59份健康孕婦血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)GDM患者的8-OHdG水平遠高于健康人群，提示8-OHdG血清水平與妊娠期糖尿病可能有一定相關(guān)性。