張倩勉 盤(pán)正華 范興 鄧玉秀 龐貞武

摘要 [目的]建立快速、準(zhǔn)確、高靈敏度的測(cè)定甜蜜素等6種甜味劑的分析方法。[方法]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）測(cè)定市售飲料中的甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷的含量，同時(shí)采用正負(fù)離子模式，并進(jìn)行多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）。[結(jié)果]該方法的線性范圍為20～1 000 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)R分別為：甜蜜素，Y=3 380X-49 100，R=0.999 7；安賽蜜，Y=8 620X+21 700，R=0.998 7；阿斯巴甜，Y=4 070X-12 400，R=0.999 7；紐甜，Y=5 930X-21 300，R=0999 4；三氯蔗糖，Y=123X+425，R=0.999 7；甜菊糖苷，Y=332X-967，R=0.997 1。最低檢出限分別為甜蜜素0.1 mg/kg、安塞蜜0.2 mg/kg、阿斯巴甜0.2 mg/kg、紐甜0.03 mg/kg、三氯蔗糖0.2 mg/kg、甜菊糖苷0.2 mg/kg。[結(jié)論]該方法操作簡(jiǎn)便、快速，是食品中甜蜜素等6種非糖類甜味劑的快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；飲料；甜味劑；含量；測(cè)定

中圖分類號(hào) TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）13-0099-04

Determination of Cyclamate Sodium etc.Six Kinds of Sweetening Agent of Non-carbohydrate in the Drinks by HPLC-MS

ZHANG Qian-mian1，PAN Zheng-hua1，F(xiàn)AN Xing1，PANG Zhen-wu2* et al （1.Guangxi and Asean Inspection Testing Center for Food and Drug Safety，Nanning，Guangxi 530021； 2.Guangxi Bagui Forest Tree Seedlings Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 53002）

Abstract [Objective] In order to establish a rapid，accurate，high sensitivity method for determination of Cyclamate Sodium etc.six kinds of sweetening agent.[Method] The contents of Cyclamate Sodium，Acesulfame，Aspartame，Neotame，Sucralose and Stevioside in commercially available beverage were determined by HPLC-MS，the positive and negative ion modes were used to conduct MRM.[Result] The results showed that a good linearity was obtained for the standard curve with 20 to 1 000 ng/mL，and the regression equation and correlation coefficient R were：Cyclamate Sodium：Y=3 380X-49 100，R=0.999 7； Acesulfame Y=8 620X+21 700，R=0.998 7； Aspartame：Y=4 070X-12 400，R=0.999 7； Neotame：Y=5 930X-21 300，R=0.999 4； Sucralose：Y=123X+425，R=0.999 7； Stevioside：Y=332X-967，R=0.997 1.The minimum detection limits were：Cyclamate Sodium：0.1 mg/kg； Acesulfame ：0.2 mg/kg； Aspartame：0.2 mg/kg； Neotame：0.03 mg/kg； Sucralose：0.2 mg/kg；Stevioside：0.2 mg/kg.[Conclusion] This method is rapid，simple，sensitive and accurate，and it is a suitable method for rapid determination of Cyclamate Sodium etc.six kinds of sweetening agent of non-carbohydrate in the food.

Key words HPLC-MS；Drink；Sweetening agent；Content；Determination

非糖類甜味劑包括天然甜味劑和人工合成甜味劑，一般甜度很高，用量極少，熱值很小，有些又不參與代謝過(guò)程，常稱為非營(yíng)養(yǎng)性或低熱值甜味劑，是甜味劑的重要品種。天然甜味劑的主要產(chǎn)品有甜菊糖苷、甘草甜素、竹芋甜素等。人工合成甜味劑的主要產(chǎn)品有糖精、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、安賽蜜、三氯蔗糖、紐甜、新橘皮苷二氫查耳酮等。

甜蜜素又名環(huán)己基氨基磺酸鈉，是一種人工合成的低熱值新型甜味劑，可代替蔗糖，或與其他甜味劑復(fù)配使用。甜蜜素已被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)、制藥業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。1969年美國(guó)科學(xué)家有試驗(yàn)表明它可導(dǎo)致白鼠膀胱腫瘤的發(fā)生，從而使美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)等許多國(guó)家和地區(qū)開(kāi)始禁止在食品中使用甜蜜素[1] 。在我國(guó)，GB 2060—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]中對(duì)甜蜜素的添加量有明確規(guī)定。

安賽蜜又稱為乙酸磺胺酸鉀、AK糖，1983年首次在英國(guó)得到批準(zhǔn)應(yīng)用，適用于焙烤食品和酸性飲料[3]。1992年，我國(guó)批準(zhǔn)安賽蜜可用于飲料、冰淇淋、糕點(diǎn)、蜜餞等。

三氯蔗糖（TGS）是由英國(guó)泰萊公司（Tate&Lyie）與倫敦大學(xué)共同研制并于1976年申請(qǐng)專利的一種新型甜味劑。這是目前唯一一種以蔗糖為原料的功能性甜味劑[4-5]。三氯蔗糖具有在人體內(nèi)不參與代謝、不被人體吸收、熱量為零等特性[6-7]；同時(shí)動(dòng)物研究表明，終生或長(zhǎng)期食用三氯蔗糖也很安全；在普通人類志愿者身上進(jìn)行的長(zhǎng)期試驗(yàn)表明，三氯蔗糖不會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生不可逆作用[8-9]。因此，三氯蔗糖被廣泛應(yīng)用在飲料、面包、果醬、糕點(diǎn)、果凍、布丁等食品加工中。

阿斯巴甜化學(xué)名稱為L(zhǎng)-天冬氨酞- L- 苯丙氨酸甲酯（APM），又稱甜味素。目前，該甜味劑已經(jīng)在100個(gè)國(guó)家及多個(gè)權(quán)威機(jī)構(gòu)得到認(rèn)可，我國(guó)于1986年正式批準(zhǔn)其在食品中使用。目前，阿斯巴甜已經(jīng)發(fā)展成為國(guó)際市場(chǎng)上的主導(dǎo)強(qiáng)力甜味劑。阿斯巴甜的優(yōu)點(diǎn)是安全性高、甜味純正[10-11]，與蔗糖或其他甜味劑混合使用有協(xié)同增效作用等[12]。

紐甜是一種人工糖精和功能性甜味劑，是目前最甜的甜味劑[13]，其在食品中的使用量根據(jù)食品的類別，在GB 2760—2014中有明確的規(guī)定[2]，但紐甜在單獨(dú)使用時(shí)無(wú)論在口感和風(fēng)味方面均與蔗糖有一定的差異， 并因其甜度大體積小， 以等甜度濃度完全替代蔗糖用于固體或半固體食品時(shí)，有時(shí)會(huì)引起產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)、黏度和體積方面發(fā)生明顯變化而影響產(chǎn)品的感官指標(biāo)[14]。為了得到口感和風(fēng)味類似于蔗糖的增甜效果，生產(chǎn)中常將紐甜與其他甜味劑復(fù)配使用。

甜菊糖苷是一種低熱量、高甜度的天然甜味劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、安全低毒、甜味高、熱值低、甜味純正，味道近似白糖，可以取代蔗糖或其他甜味劑應(yīng)用在食品以及工業(yè)生產(chǎn)中，也是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。因此經(jīng)常用于制作糖果、飲料、油炸小食品、調(diào)味品等產(chǎn)品[15-19]。用甜菊糖作為糖替代品用在加工食品以及飲料中，不僅可以降低成本，還符合食品和飲料低糖化的發(fā)展趨勢(shì)。

目前，非糖類甜味劑中每一種成分其檢測(cè)方法均不同，耗時(shí)較長(zhǎng)。為了簡(jiǎn)化檢驗(yàn)操作步驟，提高效率，筆者主要用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）同時(shí)檢測(cè)飲料中甜蜜素等6種非糖類甜味劑的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。飲料，市購(gòu)；甜蜜素（含量998%）、安賽蜜（含量99.9%），Supelco公司；阿斯巴甜（含量97.2%）、三氯蔗糖（含量99.0%），DR.Ehrenstorfer Gmbh；甜菊糖苷（含量98.0%）、紐甜（含量98.0%），安普；乙酸、甲醇均為色譜純；水為超純水。

1.1.2 儀器設(shè)備。 Agilent-1260高效液相色譜-4500 QTRAP質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司；XSE205DU分析天平。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液。

準(zhǔn)確稱取甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、甜菊糖苷6種對(duì)照品，分別置6個(gè)10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，即得甜蜜素等6種對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度分別為1.209 6、1.172 8、1.327 8、1.096 9、1.027 0、1.045 7 mg/mL。

1.2.2 混合對(duì)照品工作液。

精密吸取甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1 mL，精密吸取三氯蔗糖、甜菊糖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.2 mL，置同一50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻（濃度分別為甜蜜素2.419 μg/mL、安賽蜜2.346 μg/mL、阿斯巴甜2.656 μg/mL、三氯蔗糖4.388 μg/mL、紐甜2.054 μg/mL、甜菊糖苷4.183 μg/mL）。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別吸取上述6種混合對(duì)照品工作液0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.50 mL，分別置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 色譜條件。色譜柱：Agilent SB -aq（4.6 mm×1000 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相組成： A相為甲醇，B相為0.1%乙酸水溶液；流速0.70 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

1.2.5 質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI源）。掃描方式：正離負(fù)子同時(shí)掃描。檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

掃描模式：①負(fù)離子模式。氣簾氣：241.32 kPa；離子噴霧電壓：-4 500 V；溫度：550 ℃；噴霧電壓：-80 V；入口電壓：-10 V；碰撞室出口電壓：-14 V。

②正離子模式。氣簾氣：24132 kPa；離子噴霧電壓：4 500 V；溫度：550 ℃；噴霧電壓：40 V；入口電壓： 10 V；碰撞室出口電壓：13 V。其余質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

1.2.6 樣品處理。

1.2.6.1 供試品溶液制備。

稱取試樣2.0 g于100 mL比色管中，加50.0 mL水超聲提取30 min，冷卻后，加入2.0 mL亞鐵氰化鉀，渦旋振蕩混勻，再加入2.0 mL乙酸鋅溶液渦旋混勻，加水定容，充分混勻，轉(zhuǎn)移至離心管，5 000 r/min離心5 min，過(guò)0.22 μm濾膜，待上機(jī)。

1.2.6.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

稱取空白樣品2.0 g，共9份于100 mL比色管， 1～3份中精密加入對(duì)照混合中間液1.5 mL，作為加樣回收1， 4～9份中精密加入對(duì)照混合中間液5.0 mL，作為加樣回收2，其余步驟同“1.2.6.1”供試品溶液制備。

1.2.6.3 檢出限溶液制備。

稱取空白樣品2.0 g于100 mL比色管，加對(duì)照混合中間液1.5 mL，其余步驟同供試品溶液制備。

1.2.6.4 樣品測(cè)定方法。將處理好的待測(cè)液放入自動(dòng)進(jìn)樣器的樣品盤(pán)上，進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣5.0 μL，數(shù)據(jù)采集采用Analyst Software工作站進(jìn)行采集處理，采用Quantitative Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用外標(biāo)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出樣品溶液中各種分析物的質(zhì)量濃度。再根據(jù)以下公式得出檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果計(jì)算用公式（1），回收率計(jì)算用公式（2），檢出限計(jì)算用公式（3）。

式中，W為樣品中各分析成分的含量（μg/kg）；C為測(cè)得濃度（ng/mL）；V為稀釋倍數(shù)；M為樣品取樣量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜與色譜條件的選擇

將含有1 μg/mL的各種分析物的對(duì)照品混合溶液在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，找到最佳的電離模式。結(jié)果顯示，除了甜蜜素在正負(fù)離子模式下均有一對(duì)離子響應(yīng)較強(qiáng)外，其余成分在負(fù)離子模式下響應(yīng)較強(qiáng)，再進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量。在同一分析物中，以響應(yīng)高的離子對(duì)作為定量離子，質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。不同模式下，采用梯度洗脫，使目標(biāo)化合物能更好地與其他干擾物質(zhì)分離，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

2.2 線性關(guān)系

將標(biāo)準(zhǔn)品曲線注入液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，以峰面積為Y軸，相對(duì)質(zhì)量濃度為X軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，該方法的線性范圍為20～1 000 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)R分別為甜蜜素，Y=3 380X-49 100，R=0.999 7；安賽蜜，Y=8 620X+21 700，R=0.998 7；阿斯巴甜，Y=4 070X-12 400，R=0.999 7；紐甜，Y=5 930X-21 300，R=0.999 4；三氯蔗糖，Y=123X+425，R=0.999 7；甜菊糖苷，Y=332X-967，R=0.997 1。

2.3 回收率及精密度結(jié)果

回收率試驗(yàn)結(jié)果表明（表4），添加不同濃度的各分析物，甜蜜素回收率均值為119%，RSD值為1.8%；安賽蜜回收率均值為120%，RSD值為8.3%；阿斯巴甜平均回收率為120%，RSD值為1.7%；紐甜平均回收率為113%，RSD值為4.1%；三氯蔗糖平均回收率為114%，RSD值為3.5%；甜菊糖苷平均回收率為83%，RSD值為6.8%。

2.4 樣品檢測(cè)結(jié)果及方法檢出限

按照“1.2.6”對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后進(jìn)樣分析。正負(fù)離子模式進(jìn)行采集，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)試的飲料樣品中，甜蜜素、安賽蜜及阿斯巴甜含量分別為0.16、0.18、0.006 4 g/kg，其余成分未檢出。同時(shí)，在該試驗(yàn)條件下，在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)譜儀3倍信噪比計(jì)算目標(biāo)物組分的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 結(jié)論

該研究建立了飲料中甜蜜素等6種非糖類甜味劑含量的分析方法，通過(guò)同時(shí)采用正負(fù)離子模式進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，同時(shí)檢測(cè)飲料中6種非糖類甜味劑的含量。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好、回收率高、檢出限低。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，是食品中多種甜味劑含量的快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

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