李玉琴 魯曉嵐 敖 麗 王 凱 施建平

上海市浦東醫(yī)院(復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院)消化內(nèi)科(201399)

背景：幽門螺桿菌脂多糖(Hp-LPS)在誘導(dǎo)胃癌發(fā)生中起重要作用。目的：探討Hp-LPS對MDM2基因表達的調(diào)節(jié)作用，及其對胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。方法：分別以Hp-LPS (1 μg/mL)和大腸埃希菌(E. coli)-LPS(1 μg/mL)刺激人胃上皮細胞株GES-1和胃癌細胞株HGC-27、MKN45 24 h，以蛋白質(zhì)印跡法檢測MDM2表達。構(gòu)建MDM2啟動子區(qū)熒光素酶報告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HGC-27細胞，以Hp-LPS刺激細胞24 h后，檢測報告基因相對熒光素酶活性。構(gòu)建MDM2 RNA干擾質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)染三株細胞，行流式細胞術(shù)細胞凋亡檢測和Transwell細胞侵襲實驗。建立裸鼠MKN45、HGC-27細胞胃癌異種移植瘤模型并予尾靜脈注射siRNA-hMDMA2-3，觀察移植瘤生長情況。結(jié)果：Hp-LPS可增加MDM2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)胃上皮細胞和胃癌細胞MDM2蛋白表達。轉(zhuǎn)染siRNA-hMDMA2-3的GES-1、HGC-27、MKN45細胞，細胞凋亡較轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA者顯著增加(P<0.05)，侵襲能力顯著減弱(P<0.05)。經(jīng)siRNA-hMDMA2-3干預(yù)的異種移植瘤模型裸鼠，腫瘤生長抑制率顯著高于以陰性對照siRNA干預(yù)者(P<0.05)。結(jié)論：Hp-LPS可能通過誘導(dǎo)MDM2表達引起胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化，而抑制MDM2表達可促進胃上皮細胞和胃癌細胞凋亡并抑制其侵襲能力，發(fā)揮抑制胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化和胃癌生長的作用。

胃癌是嚴重危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問題，約半數(shù)早期胃癌患者無任何癥狀，早期診斷率低，死亡率較高。積極尋求可疑的致病危險因素，將為胃癌病因探討和預(yù)防提供理論依據(jù)[1-2]。目前認為，幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)感染與宿主和環(huán)境因素的共同作用與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。

MDM2(murine double minute 2)基因定位于人染色體12q13-14，編碼蛋白由491個氨基酸組成，可通過與抑癌基因p53結(jié)合，抑制其誘導(dǎo)細胞周期阻滯和細胞凋亡功能。已有文獻報道，腸化生胃黏膜和胃癌組織中MDM2表達增高與Hp感染相關(guān)[3-4]，但確切機制尚未闡明。在Hp相關(guān)毒力因子中，CagA、VacA、尿素酶與胃癌的關(guān)系已有大量文獻報道，而另一毒力因子脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)則未受到足夠的重視。發(fā)表于Gastroenterology[5]、ClinicalCancerResearch[6]等國際權(quán)威雜志的相關(guān)研究表明，Hp-LPS在促進Hp定植和胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用不容忽視。本研究擬探討Hp-LPS對MDM2基因表達的調(diào)節(jié)作用，及其對胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響，以期為進一步理解胃癌發(fā)生的分子機制以及研究新的胃癌防治策略提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、體外實驗

1. 細胞株和主要試劑：人胃上皮細胞株GES-1和胃癌細胞株HGC-27、MKN45(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。Hp-LPS[卡邁舒(上海)生物科技有限公司]；大腸埃希菌(E.coli)-LPS(Sigma-Aldrich)；兔抗小鼠MDM2多克隆抗體(博士德生物工程有限公司)；內(nèi)參GAPDH抗體、攜帶MDM2 RNA干擾片段siRNA-hMDMA2的質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒siRNA-NC、Annexin V-APC/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；MDM2啟動子區(qū)熒光素酶報告基因質(zhì)粒(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)；Transwell小室(Corning Incorporated)；Matrigel(BD Biosciences)。

2. 細胞培養(yǎng)：從液氮中取出GES-1、HGC-27、MKN45細胞凍存管，立即置于37～40 ℃ 溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解；將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入約5 mL培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻；細胞懸液800～1 000 r/min離心5 min，棄上清夜；于細胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻；將細胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶內(nèi)，補足培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

3. 蛋白質(zhì)印跡法檢測MDM2表達：三株細胞在無血清培養(yǎng)條件下分別加入Hp-LPS 1 μg/mL、E.coli-LPS 1 μg/mL共培養(yǎng)24 h，同時設(shè)立不予干預(yù)的對照組。提取各組細胞總蛋白，行10% SDS-PAGE電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，與MDM2抗體(1∶500稀釋)4 ℃搖床振蕩孵育過夜；加入5%脫脂奶粉封閉液稀釋的二抗，室溫搖床振蕩反應(yīng)2 h，ECL法曝光、顯影、定影。Gel-Pro 32軟件對結(jié)果進行灰度分析，計算MDM2蛋白相對表達量。

4. 熒光素酶報告基因?qū)嶒灒恨D(zhuǎn)染前24 h將HGC-27細胞按0.25×105/孔接種于24孔板，轉(zhuǎn)染前4 h更換新鮮培養(yǎng)基；將0.8 μg含MDM2啟動子區(qū)551～787 bp基因序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒和0.02 μg β-gal內(nèi)參照質(zhì)粒(載體為pGL3)共轉(zhuǎn)染HGC-27細胞；轉(zhuǎn)染4～6 h后換液，分別以Hp-LPS 0.1 μg/mL和1 μg/mL刺激細胞24 h，同時設(shè)立不予刺激的對照組。使用熒光素酶檢測儀檢測報告基因和內(nèi)參照基因熒光素酶活性，兩者比值為報告基因相對熒光素酶活性。實驗設(shè)3個復(fù)孔。

5. 干擾質(zhì)粒篩選：將適當數(shù)量的HGC-27細胞接種于細胞培養(yǎng)板，每孔加入不含抗菌藥物的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時細胞密度達到30%～50%。分別稀釋siRNA質(zhì)粒和Lipofectamine 2000，將兩者混勻，室溫放置20 min；將混合液加入HGC-27細胞培養(yǎng)孔(500 μL培養(yǎng)基)中，輕輕混勻；培養(yǎng)4～6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。根據(jù)蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果篩選出干擾效果最好的siRNA質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

6. Annexin V-APC/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡：將三株對數(shù)生長期細胞消化、接種于6孔板，次日待細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染干擾效果最佳的質(zhì)粒siRNA-hMDMA2-3和siRNA-NC，同時設(shè)立不予轉(zhuǎn)染的對照組。作用48 h后，0.25%胰酶(不含EDTA)消化、收集細胞；PBS洗滌2次(2 000 r/min離心5 min)，收集5×105個細胞，再加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL 7-AAD混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min。流式細胞儀Ex/Em=633 nm/660 nm檢測Annexin V-APC紅色熒光；Ex/Em=546 nm/647 nm檢測7-AAD紅色熒光。

7. Transwell細胞侵襲實驗：將三株對數(shù)生長期細胞消化、接種于6孔板，次日待細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染干擾效果最佳的質(zhì)粒siRNA-hMDMA2-3和siRNA-NC，同時設(shè)立不予轉(zhuǎn)染的對照組。作用48 h后，棄去含血清培養(yǎng)基，以不完全培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。Matrigel基質(zhì)膠4 ℃過夜融化，以不完全培養(yǎng)基1∶1稀釋；于Transwell小室上室中加入30 μL稀釋的Matrigel，37 ℃孵育120 min，使Matrigel聚合成膠。消化、計數(shù)細胞，以不完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×105/mL，取100 μL細胞懸液加入上室，下室加入500 μL含血清完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。以棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細胞，倒置，風(fēng)干；于24孔板中加入500 μL 0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒于染料中，37 ℃ 30 min后取出，PBS清洗，于顯微鏡下所見直徑上取3個視野，拍照(×200)，計數(shù)穿膜細胞。

二、動物實驗

1. 實驗動物：BALB/c裸鼠，雌性，4～5周齡，體質(zhì)量18～22 g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0018，合格證編號：2013001830396。實驗通過倫理委員會審批，倫理編號：(2019)No.(WZ-002)。

2. 異種移植瘤模型制備、分組和給藥：收集培養(yǎng)的MKN45、HGC-27細胞懸液，濃度調(diào)整至1×107/mL，以每只0.1 mL接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，每一細胞株9只。待腫瘤長至50 mm3左右，按接種細胞將動物隨機分為3組，共6組，并予相應(yīng)處理：①MKN45對照組；②MKN45-siRNA-NC組；③MKN45-siRNA-hMDMA2-3組；④HGC-27對照組；⑤HGC-27-siRNA-NC組；⑥HGC-27-siRNA-hMDMA2-3組。兩組對照組尾靜脈注射PBS 0.1 mL/10 g，其余四組尾靜脈注射相應(yīng)藥物500 μg/kg，均為一次性給藥。

3. 觀測指標：動態(tài)測量腫瘤體積變化，觀察給藥過程中和給藥后動物活動、外觀、精神、體質(zhì)量的變化。給藥4周后處死裸鼠，手術(shù)剝?nèi)×鰤K并稱重，測量腫瘤體積(1/2×a×b2，a、b分別為腫瘤長徑和短徑)，計算腫瘤生長抑制率[(對照組平均腫瘤質(zhì)量-給藥組平均腫瘤質(zhì)量)/對照組平均腫瘤質(zhì)量×100%]。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、Hp-LPS對MDM2表達的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，GES-1、HGC-27、MKN45細胞在無血清培養(yǎng)條件下與Hp-LPS共培養(yǎng)24 h后，MDM2表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，三株細胞與E.coli-LPS共培養(yǎng)后則未見MDM2表達有明顯變化(圖1)，提示Hp-LPS能誘導(dǎo)胃上皮細胞和胃癌細胞MDM2表達。

*與對照組和E. coli-LPS組比較，P<0.01

二、Hp-LPS對MDM2基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

為評價Hp-LPS與MDM2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性是否相關(guān)，本研究構(gòu)建MDM2啟動子區(qū)熒光素酶報告基因質(zhì)粒，并將之瞬時轉(zhuǎn)染入HGC-27細胞。檢測顯示，經(jīng)Hp-LPS 1 μg/mL刺激24 h的HGC-27細胞，報告基因相對熒光素酶活性明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)，提示Hp-LPS可增加MDM2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性。

三、最佳干擾效果質(zhì)粒篩選

構(gòu)建siRNA-hMDMA2干擾質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒siRNA-NC并轉(zhuǎn)染HGC-27細胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示質(zhì)粒siRNA-hMDMA2-3干擾效果最佳(圖3)。

四、干擾MDM2表達對細胞凋亡的影響

流式細胞分析顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-hMDMA2-3的GES-1、HGC-27和MKN45細胞，細胞凋亡均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)，提示通過RNA干擾沉默MDM2表達可誘導(dǎo)胃上皮細胞和胃癌細胞凋亡。

*與對照組比較，P<0.01

圖3 siRNA-hMDMA2-3為最佳干擾效果質(zhì)粒

五、干擾MDM2表達對細胞侵襲能力的影響

Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-hMDMA2-3的GES-1、HGC-27和MKN45細胞，穿膜細胞數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)，提示通過RNA干擾沉默MDM2表達可抑制胃上皮細胞和胃癌細胞的侵襲能力。

六、動物實驗

為評估干擾MDM2表達對胃癌生長的影響，本研究建立裸鼠MKN45和HGC-27胃癌異種移植瘤模型，并分別予尾靜脈注射PBS(對照組)、siRNA-NC和siRNA-hMDMA2-3進行干預(yù)。結(jié)果顯示在干預(yù)后4周中，siRNA-hMDMA2-3組裸鼠腫瘤生長較siRNA-NC組和對照組明顯減慢，第4周末腫瘤體積最小(圖6A1、6A2)、質(zhì)量最輕(圖6B1、6B2)，腫瘤生長抑制率明顯高于siRNA-NC組(MKN45細胞移植瘤：55.2%對37.0%；HGC-27細胞移植瘤：53.9%對32.1%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后4周中，三組間裸鼠體質(zhì)量變化無明顯差異(P>0.05)(圖6C1、6C2)。上述結(jié)果表明，通過RNA干擾沉默MDM2表達可顯著抑制裸鼠胃癌異種移植瘤生長。

討 論

與E.coli-LPS一樣，Hp-LPS亦由特異性多糖、核心多糖和脂類A組成，具有一定的毒性以及免疫調(diào)節(jié)、免疫刺激作用，其細胞毒性弱于E.coli-LPS，內(nèi)毒素活性與E.coli-LPS相當，與胃黏膜炎癥反應(yīng)的持續(xù)密切相關(guān)[7-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)LPS可通過調(diào)節(jié)hedgehog信號通路發(fā)揮作用[8-9]，Hp-LPS可能通過影響該信號通路參與胃癌發(fā)生[8]。而本研究旨在探討Hp-LPS是否通過調(diào)控MDM2表達參與胃癌發(fā)生。

*與siRNA-NC組和對照組比較，P<0.01

*與siRNA-NC組和對照組比較，P<0.01

*與siRNA-NC組比較，P<0.01

MDM2是一種進化保守基因，其既是抑癌基因p53的靶基因，也是p53功能的負性調(diào)控因子，兩者間形成一個負反饋環(huán)，即MDM2表達水平由野生型p53調(diào)控，p53激活則MDM2表達增加，繼而抑制p53轉(zhuǎn)錄激活，引起MDM2表達下調(diào)。在骨肉瘤、腦腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、賁門腺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤組織中可見MDM2高表達[10-12]。在Hp感染胃黏膜中，MDM2高表達與胃癌前病變和胃癌發(fā)生密切相關(guān)[4]。除與胃癌易感性相關(guān)外，MDM2高表達還是胃癌預(yù)后不良的危險因素[13]。

本研究結(jié)果顯示，與E.coli-LPS相比，經(jīng)Hp-LPS處理的GES-1、HGC-27、MKN45細胞MDM2表達顯著增加，表明Hp-LPS能誘導(dǎo)入胃上皮細胞和胃癌細胞MDM2表達。隨后，本研究進一步通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明，Hp-LPS能顯著增加MDM2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性。通過RNA干擾沉默MDM2表達后，三株細胞均表現(xiàn)為細胞凋亡增加和侵襲能力減弱；而予Hp-LPS刺激上調(diào)MDM2表達后，三株細胞均表現(xiàn)為凋亡減少、侵襲能力增強(實驗結(jié)果未列出)。上述結(jié)果提示抑制MDM2表達可降低胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化能力和腫瘤細胞的惡性行為，誘導(dǎo)其表達則可促進胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化。裸鼠胃癌異種移植瘤實驗進一步證明抑制MDM2表達可減緩腫瘤生長，注射siRNA-hMDMA2-3的裸鼠腫瘤生長抑制率明顯增高。

綜上所述，Hp可能通過其毒力因子LPS誘導(dǎo)MDM2表達，引起胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化，而抑制MDM2表達可促進胃上皮細胞和胃癌細胞凋亡并抑制其侵襲能力，發(fā)揮抑制胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化和胃癌生長的作用。在本研究基礎(chǔ)上進一步深入闡明Hp-LPS在胃癌發(fā)生中的作用，對于尋找胃癌預(yù)防和治療新的靶點具有重要意義。