袁麗欣 徐煒區(qū) 林柏佑 臧德躍

摘要：?目的：對(duì)一種以海藻酸鈉、羧甲基纖維素為主要成分的止血微球進(jìn)行皮膚致敏、皮內(nèi)反應(yīng)和溶血試驗(yàn)研究，為該種止血微球在醫(yī)學(xué)臨床使用提供生物安全依據(jù)。方法：根據(jù)GB-T 16886中豚鼠最大劑量試驗(yàn)、動(dòng)物皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)和與血液相互作用試驗(yàn)選擇的要求進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果：皮膚致敏試驗(yàn)動(dòng)物在觀察期內(nèi)致敏反應(yīng)等級(jí)均為0;皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)動(dòng)物在觀察期內(nèi)的反應(yīng)均為無(wú)紅斑、無(wú)水腫;溶血率為0.9%。結(jié)論：該種止血微球無(wú)致敏反應(yīng)和皮內(nèi)反應(yīng)，溶血率符合標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)，可進(jìn)一步用于臨床研究。

關(guān)鍵詞：止血微球 皮膚致敏 皮內(nèi)反應(yīng) 溶血

【中圖分類號(hào)】R322 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ???【文章編號(hào)】2107-2306（2019）04-241-04

止血對(duì)術(shù)中減少失血、保持術(shù)中視野清晰、防止重要組織損傷、保證手術(shù)安全以及術(shù)后創(chuàng)口愈合等均有重要意義，止血微球可用于各種復(fù)雜、大面積、噴射狀出血的迅速止血，顆粒狀分子迅速吸收血液中的水分^【1】，并將血液中有形成分（如血小板、紅細(xì)胞、白蛋白、凝血酶和纖維蛋白等）聚集在顆粒表面，形成一種凝膠混合物，達(dá)到即刻止血的功效。目前市面上大部分止血微球產(chǎn)品以殼聚糖為主要成分，本文所研究的止血微球主要成分為海藻酸鈉、羧甲基纖維素，海藻酸鈉是來(lái)源于褐藻中的一種海藻多糖，由于其強(qiáng)成膠性能，可在傷口表面形成凝膠，減輕病人的疼痛和預(yù)防傷口的二次出血^【2】;羧甲基纖維素是天然纖維素與氯乙酸經(jīng)化學(xué)改性得到的一種衍生物，其水溶液具有增稠、成膜、黏結(jié)、水分保持、膠體保護(hù)、乳化等作用^【3】。由于該成分的止血微球作為一種表面接觸醫(yī)療器械，直接用于出血體表，不僅需要具有良好的止血性能，還需要良好的生物相容性，生物相容性是指生物醫(yī)用材料與人體之間相互作用產(chǎn)生的各種生物、物理、化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，包括組織相容性、力學(xué)相容性、血液相容性以及免疫相容性等方面，是評(píng)價(jià)生物材料安全性與功能性的重要指標(biāo)，也是生物材料研究中始終貫穿的主題^【4】。本文主要對(duì)該產(chǎn)品生物相容性中的皮膚致敏、皮內(nèi)反應(yīng)及溶血的作出試驗(yàn)研究，皮膚致敏試驗(yàn)采用最大劑量法，最大劑量法為最敏感的方法^【5】，皮內(nèi)試驗(yàn)通過(guò)皮內(nèi)注射材料浸提液，對(duì)材料在試驗(yàn)條件下產(chǎn)生刺激反應(yīng)的潛能做出評(píng)定;溶血被認(rèn)為是一種重要的反映材料與血液相互作用的篩選試驗(yàn)^【6】。通過(guò)以上三個(gè)試驗(yàn)對(duì)主要成分為海藻酸鈉、羧甲基纖維素的止血微球進(jìn)行評(píng)價(jià)，為該產(chǎn)品的發(fā)展及其在生物臨床應(yīng)用中提供安全可靠的依據(jù)。

1試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)樣品為止血微球，在無(wú)菌操作下，根據(jù)廠家提供該樣品的無(wú)膨脹吸收量，加入相應(yīng)生理鹽水后充分溶脹后，根據(jù)GB16886.12的標(biāo)準(zhǔn)要求加入相應(yīng)浸提介質(zhì)，輕輕振搖，將微球充分浸泡在并均勻分散在浸提介質(zhì)中，置37℃恒溫烘箱中浸提72小時(shí)，72小時(shí)后將浸提液和浸泡后的微球全部轉(zhuǎn)移到離心管中，2646×g離心10分鐘，取浸提液上清經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后作為試驗(yàn)的樣品溶液。

1.2試驗(yàn)體系

普通級(jí)白化豚鼠50只，雌雄兼用，雌鼠未產(chǎn)并無(wú)孕，體重范圍：300g～400g，動(dòng)物來(lái)源，廣州市花都區(qū)花東信華試驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2014-0023;

新西蘭兔，體重范圍：2.5kg～2.8kg，動(dòng)物來(lái)源：廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。

試驗(yàn)動(dòng)物管理按照ISO 10993-2的規(guī)定進(jìn)行，每天供給由廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供的飼料，給予合格生活飲用水。監(jiān)測(cè)每日的室溫，并將溫度范圍控制在20℃～26℃之間。監(jiān)測(cè)每日的室內(nèi)濕度，相對(duì)濕度控制在40%～70%范圍。

1.3主要試劑

精制棉籽油：ACROS公司;0.9%氯化鈉注射液：四川科倫藥業(yè)股份有限公司;弗氏完全佐劑：SIGMA公司;二硝基氯苯溶液：阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.4主要儀器

電子天平（島津 UX4200H）、鼓風(fēng)恒溫烘箱（BINDER FD115）、細(xì)胞離心機(jī)（貝克曼庫(kù)爾特 Allegra X-12R）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津 UV-2600）、恒溫水浴鍋（Memmert WNB29）

2.試驗(yàn)方法

2.1皮膚致敏試驗(yàn)

備皮：取上述豚鼠50只，在試驗(yàn)前4h將動(dòng)物背部4cm×6cm被毛除去，隨機(jī)分成5組，極性浸提液組10只，極性對(duì)照組10只;非極性浸提液組10只，非極性對(duì)照組10只;陽(yáng)性對(duì)照組10只。

皮內(nèi)誘導(dǎo)：按圖1 所示，在每只動(dòng)物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位成對(duì)皮內(nèi)注射0.1mL。

1—頭部 ???2—0.1mL皮內(nèi)注射點(diǎn) ???3—去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位 ???4—尾部

部位A：注射弗氏完全佐劑與浸提介質(zhì)以50：50（體積比）比例混合的穩(wěn)定性乳化劑。

部位B：注射試驗(yàn)樣品浸提液;陰性及陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物分別注射相應(yīng)對(duì)照液。

部位C：注射試驗(yàn)樣品浸提液以50：50的體積比例與弗氏完全佐劑和浸提介質(zhì)（50%）配制成的穩(wěn)定性乳化劑混合液;陰性及陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物分別注射相應(yīng)對(duì)照溶液以50：50的體積比例與佐劑配制成的乳化劑。

局部誘導(dǎo)：皮內(nèi)誘導(dǎo)階段后6d，試驗(yàn)區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉按摩導(dǎo)入皮膚。24h后，采用面積約8cm²的吸收性紗布?jí)K分別置于試驗(yàn)樣品浸提液、陰性對(duì)照液及陽(yáng)性對(duì)照液中浸透后，分別局部貼敷于每只動(dòng)物的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位，覆蓋誘導(dǎo)注射點(diǎn)。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于48h后除去包扎帶和敷貼片。

激發(fā)：局部誘導(dǎo)階段后15d，將約2.5cm×2.5cm大小的吸收性紗布?jí)K分別置于試驗(yàn)樣品浸提液、陰性對(duì)照液及陽(yáng)性對(duì)照液中浸透后，分別局部貼敷于誘導(dǎo)階段未試驗(yàn)部位（每只動(dòng)物的上腹部）。用封閉式包扎帶固定，并于24h后除去包扎帶和敷貼片。

觀察：除去敷貼片后24h和48h觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)部位皮膚，參照GB/T 16886.10 Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1 示）對(duì)每一激發(fā)部位和每一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)并記錄。

結(jié)果評(píng)價(jià)：陰性對(duì)照組動(dòng)物等級(jí)小于1，而樣品組中等級(jí)大于或等于1時(shí)一般提示致敏。如陰性對(duì)照組動(dòng)物等級(jí)大于或等于1時(shí)，樣品組動(dòng)物反應(yīng)超過(guò)陰性對(duì)照組中最嚴(yán)重的反應(yīng)則認(rèn)為致敏。

2.2皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

備皮：取健康家兔3只，試驗(yàn)前4h在脊柱兩側(cè)各剪剃約10cm×15cm區(qū)域兔毛，盡量避免機(jī)械損傷皮膚，以備注射浸提液。

給藥：在每只兔脊柱一側(cè)的前5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL極性溶劑制備的樣品浸提液，同一側(cè)的后5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL非極性溶劑制備的樣品浸提液;在每只兔脊柱另一側(cè)的前5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL極性溶劑對(duì)照液，同一側(cè)的后5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL非極性溶劑對(duì)照液（見(jiàn)圖2示）。

1-頭端 ???2-0.2mL極性浸提液注射點(diǎn)

3-0.2mL非極性浸提液注射點(diǎn)

4-0.2mL極性溶劑對(duì)照液注射點(diǎn)

5-0.2mL非極性溶劑對(duì)照液注射點(diǎn) ??6-尾端

觀察：注射后即刻以及24h、48h和72h觀察和記錄各注射部位狀況，根據(jù)GB/T 16886.10-2017/ISO 10993-10：2010《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第10部分：刺激與皮膚致敏試驗(yàn)》動(dòng)物皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)記分系統(tǒng)（見(jiàn)表2）對(duì)每一觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應(yīng)評(píng)分，并記錄試驗(yàn)結(jié)果。在72h評(píng)分后，分別將每只動(dòng)物試驗(yàn)樣品或空白對(duì)照的24h、48h和72h的全部紅斑與水腫記分相加，再除以15[3（記分時(shí)間點(diǎn)）×5（試驗(yàn)樣品或空白對(duì)照注射點(diǎn)）]，計(jì)算出每只動(dòng)物試驗(yàn)樣品或空白對(duì)照的記分。三只動(dòng)物記分相加后除以3得出每一試驗(yàn)樣品和相應(yīng)空白對(duì)照的總平均記分。試驗(yàn)樣品記分減去空白對(duì)照記分可得出試驗(yàn)樣品最終記分。如試驗(yàn)樣品最終記分不大于1.0，則符合該試驗(yàn)要求。

2.3溶血試驗(yàn)

兔血制備

由健康家兔心臟采血10mL，加質(zhì)量濃度20g/L草酸鉀溶液0.5mL，制備成新鮮抗凝兔血。取新鮮抗凝兔血8mL，加質(zhì)量濃度9g/L氯化鈉注射液10mL稀釋備用。

血液與被測(cè)樣品的相互作用

在無(wú)菌操作下，分別取樣品10mL至3支試管中，作為樣品組;陰性對(duì)照組3支試管，每管加入10mL0.9%氯化鈉注射液;陽(yáng)性對(duì)照組3支試管，每管加入蒸餾水10mL。

全部試管放入37℃恒溫水浴中保溫30min后，每支試管加入0.2mL稀釋兔血，輕輕混勻，置37℃水浴中繼續(xù)保溫60min。

倒出管內(nèi)液體以800g離心5min，吸取上清液移入比色皿內(nèi)，用紫外分光光度計(jì)在545nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

根據(jù)測(cè)得的吸光度計(jì)算樣品的溶血率。

A_TS-A_NC

溶血率（%）= ——————×100%

A_PC-A_NC

式中：A_TS—樣品組吸光度

A_NC—陰性對(duì)照組吸光度

A_PC—陽(yáng)性對(duì)照組吸光度

陰性對(duì)照管的吸光度應(yīng)不大于0.03;陽(yáng)性對(duì)照管的吸光度應(yīng)為0.8±0.3。

3.試驗(yàn)結(jié)果

3.1皮膚致敏結(jié)果

陰性對(duì)照組、樣品組動(dòng)物在觀察期內(nèi)致敏反應(yīng)等級(jí)均為0，陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物在觀察期內(nèi)致敏反應(yīng)等級(jí)為2～3。（詳見(jiàn)表3）

3.2皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

樣品組和對(duì)照組動(dòng)物在觀察期內(nèi)的反應(yīng)均為無(wú)紅斑、無(wú)水腫，樣品組和對(duì)照組的總平均記分之差為0。（詳見(jiàn)表4）

3.3溶血試驗(yàn)結(jié)果

樣品組和對(duì)照組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。樣品的溶血率為0.9%。

4.討論

在本試驗(yàn)條件中，以海藻酸鈉、羧甲基纖維素為主要成分的止血微球所制備的浸提液在皮膚致敏反應(yīng)試驗(yàn)（最大劑量法）中，根據(jù)Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，樣品浸提液組未見(jiàn)引起皮膚致敏反應(yīng)，而涂抹2，4-而硝基氯苯的陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠均產(chǎn)生2～3級(jí)反應(yīng);皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)無(wú)紅斑、無(wú)水腫現(xiàn)象出現(xiàn);溶血率為0.9%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)。綜上所述，該成分的止血微球在皮膚致敏、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)中均有較好安全性，可進(jìn)一步用于臨床研究。

參考文獻(xiàn)

[1]李旭麗 止血微球關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)的討論 中國(guó)醫(yī)療器械信息 1006-6586（2017）12-0012-02

[2]Chan L W， Jin Y， Heng P W S. Cross-linking mechanisms of calcium and zinc in production of alginate microspheres [J] . International Journal of Pharmaceutics， 2002， 242（1/2）：255-258

[3]李健，劉雅南，劉寧，劉濤 羧甲基纖維素的制備研究及應(yīng)用現(xiàn)狀 食品工業(yè)科技

[4]鄧樂(lè)君，樊鴻浩，李偉達(dá)，朱晉輝，李茹冰 可吸收止血材料的生物相容性研究進(jìn)展 中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào) 0258-8021（2016）02-0241-06

[5]FRANKILD，S. V?LUND， A.， WAHLBERG， J.E.et al.， Comparison of the sensitivities of the Buehler test and the guinea pig maximization test for predictive testing of contact allergy， Acta Derm. Venereol.， 80， pp.256-262，2000

[6]侯麗，喬春霞，趙增琳 解讀ISO 10993-4：2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇》 1674-1633（2018）11-0001-06