邱青瑞

摘要：為了對一例疑為糞腸球菌感染的羔羊進(jìn)行病原鑒定，本研究采用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法和PCR方法分別進(jìn)行分離與鑒定。結(jié)果根據(jù)菌落形態(tài)、細(xì)菌染色特性及生化特性，鑒定出分離的細(xì)菌為羊源糞腸球菌。

關(guān)鍵詞：糞腸球菌；培養(yǎng)特性；生化特性；溶血

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）屬于鏈球菌科腸球菌屬，是鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌，在自然界和動物糞便中大量存在，是人和動物腸道內(nèi)的主要菌群。糞腸球菌感染對畜牧養(yǎng)殖業(yè)的影響不容忽視，該菌為機(jī)會感染菌，且對多種抗生素都有耐藥性，發(fā)病一般呈散發(fā)性流行，當(dāng)畜群受應(yīng)激等外源因素導(dǎo)致免疫力降低時可發(fā)生感染，目前國內(nèi)已有糞腸球菌引起牛、羊、豬、水貂、鷓鴣和家禽發(fā)病的報道。因此，通過實驗室對病原菌分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)鑒定對糞腸球菌的防控具有重要意義。

2016年11月山東東營某羊場羔羊發(fā)生了一種以敗血癥和神經(jīng)癥狀為主要特征的傳染病，該病發(fā)病急，羔羊發(fā)病后預(yù)后不良，死亡率高達(dá)20%以上，給羊場造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病羔羊出現(xiàn)體溫升高，高達(dá)41～42℃，精神沉郁，消瘦衰弱，以及呼吸困難等癥狀，個別病羊全身抽搐、站立不穩(wěn)。剖檢整個腦部表面及切面均有出血點，嚴(yán)重者有灰色壞死灶，肺臟呈彌漫性充血、出血，外觀呈大理石樣；脾臟及腸系膜淋巴結(jié)腫大。采集發(fā)病羔羊的病料經(jīng)實驗室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、動物回歸試驗及PCR檢測確定為糞腸球菌感染。

1材料與方法

1.1主要試驗材料

病料分別采集于山東東營幾個羊場死亡的羔羊，體重為18～20g的健康小鼠購自新疆大學(xué)實驗動物中心。

1.2主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarkerDL2000等購自大連寶生物工程有限公司。膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。鏈球菌瓊脂（K-F）、細(xì)菌生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。MH培養(yǎng)基、酵母浸出物、胰蛋白胨等試劑購北京索萊寶科技有限公司，其他化學(xué)試劑如氯仿、異丙醇和乙醇等均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)

剖檢死亡羔羊，無菌采集部分病死羔羊腦、脾臟、肺臟和腸系膜淋巴結(jié)，用作細(xì)菌分離。將肺臟、腦及腸系膜淋巴結(jié)等病變部位研磨后接種于血液瓊脂培板、鏈球菌增菌培養(yǎng)肉湯及改良馬丁肉湯中，分別于放置于37℃的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察生長情況及菌落特征。細(xì)菌涂片，分別進(jìn)行革蘭氏、吉姆薩或瑞氏染色，鏡檢。

1.4細(xì)菌的生化鑒定

將所分離細(xì)菌的鮮血馬丁肉湯培養(yǎng)物，進(jìn)行高鹽等不同培養(yǎng)條件鑒定，并挑單菌落轉(zhuǎn)移接種于生化反應(yīng)管，根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司說明書進(jìn)行，觀察生化特性鑒定結(jié)果。

1.5溶血實驗

將所分離的糞腸球菌接種于5%的兔鮮血LB平板，37℃培養(yǎng)48h后鑒定溶血性，以菌落周圍出現(xiàn)溶血圈者判為陽性。

1.6細(xì)菌的致病性動物回歸試驗

將分離的糞腸球菌用滅菌鮮血馬丁肉湯增菌培養(yǎng)12～24h，選取體重為18～20g的健康小鼠8只，隨機(jī)分成2組，每組4只，第1組小鼠腹腔注射0.2mL/只，第2組腹腔注射鮮血馬丁肉湯作為對照組。

1.7細(xì)菌的PCR鑒定

從GenBank中下載糞腸球菌序列，參照馬立艷等文獻(xiàn)中16srRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1，056bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)

取病變部位直接涂片瑞氏染色鏡檢可見短鏈排列的球菌，研磨后接種培養(yǎng)基后革蘭染色可見長鏈狀排列的革蘭陽性球菌，接種兔鮮血LB平板后出現(xiàn)表面光滑濕潤、邊緣整齊的圓形小菌落，呈？溶血，能在6.5%Nacl和PH9.6的條件下生長。

2.2細(xì)菌的生化鑒定

本實驗分離的糞腸球菌糖發(fā)酵特性不活潑，只能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖，乳糖、硫化氫、氧化酶試驗、檸檬酸鹽和甲基紅試驗均為陰性，VP試驗呈陽性。

2.3細(xì)菌的致病性動物回歸試驗

將分離的糞腸球菌用鮮血馬丁肉湯增菌培養(yǎng)24h，腹腔接種健康小鼠后，第1組小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，均在48～72h內(nèi)死亡，對照組小鼠無明顯臨床癥狀。剖檢死亡小鼠，腦部有灰色壞死灶，肺臟呈大理石樣，腸系膜淋巴結(jié)腫大。取其腦及肺臟涂片染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌，瑞氏染色結(jié)果也相同。

2.4細(xì)菌的PCR鑒定

提取分離菌株的DNA為模板，以不加模板為陰性對照，通過特異性的16srRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳可見1056bp左右的特異條帶，與預(yù)期目的條帶位置一致，陰性對照未見條帶（圖1）。

3討論

糞腸球菌是人和動物腸道內(nèi)的主要菌群之一，該菌不僅是人腸球菌感染和死亡的主要致病菌，而且近年來畜禽感染糞腸球菌的報道也越來越多，該菌作為新的人畜共患傳染病病原菌，引起了人們廣泛關(guān)注。本試驗中分離的病原菌從培養(yǎng)特性、染色鏡檢、溶血特性及生化特性分析都符合糞腸球菌的生物學(xué)特性。因此可初步判定該分離菌為致病性糞腸球菌。將分離菌的培養(yǎng)產(chǎn)物接種小鼠后，出現(xiàn)敗血性及神經(jīng)癥狀，動物回歸試驗證實該菌具有較強(qiáng)的致病性，剖檢癥狀與糞腸球菌的癥狀一致。

目前對分離菌常根據(jù)典型臨床癥狀、剖檢病理變化及細(xì)菌分離培養(yǎng)特性、染色及生化特性等進(jìn)行分離鑒定。但鏈球菌種類繁多，該腸球菌與普通鏈球菌的不同在于在生化反應(yīng)上能耐受高鹽和高SSS堿培養(yǎng)，溶血特性也相同。分子生物學(xué)鑒定腸球菌的保守16SrRNA基因鑒定方法日益受到青睞，該方法快速簡便，準(zhǔn)確率高。本實驗采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定方法和分子生物學(xué)方法，對采集自病死羔羊的分離細(xì)菌進(jìn)行了全面鑒定，結(jié)果顯示為糞腸球菌感染。endprint