李凱軍 陳俊

摘要：目的：探討miR-146a對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8的調(diào)節(jié)作用。方法：本研究設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組兩組，通過原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得體外培養(yǎng)眼眶成纖維細(xì)胞，再利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細(xì)胞，過表達(dá)或抑制眼眶成纖維細(xì)胞miR-146a的表達(dá)水平，進(jìn)而通過ELISA法檢測IL-6和IL-8的表達(dá)水平。結(jié)果：TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞48h上清液中IL-6和IL-8水平明顯升高，結(jié)果與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞中，上調(diào)miR-146a表達(dá)水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同時(shí)，下調(diào)miR-146a表達(dá)水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。結(jié)論：過表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)，同時(shí)抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：甲狀腺相關(guān)性眼病，眼眶成纖維細(xì)胞，miR-146a，IL-6，IL-8

【中圖分類號】R581.3??? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A??? 【文章編號】2107-2306（2019）03-022-02

引言

甲狀腺相關(guān)性眼病（Thyroid-associated ophthalmopathy， TAO），是一種器官特異性自身免疫性疾病[1]。眼眶成纖維細(xì)胞是甲狀腺相關(guān)眼病的自身免疫靶點(diǎn)和效應(yīng)細(xì)胞[2]。IL-6是主要的促炎細(xì)胞因子[3]。成纖維細(xì)胞中IL-8的產(chǎn)生參與甲狀腺相關(guān)眼病炎癥進(jìn)展[4]。

miR-146a是典型的多功能miRNA，參與免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞增殖，分化，凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)代謝和其他生命過程[5]。楊文娟等[6]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺相關(guān)眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA-146a相對表達(dá)量較正常人明顯下降。然而，miR-146a對眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的影響仍不清楚。本研究旨在通過原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲取純化的眼眶成纖維細(xì)胞，利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細(xì)胞，過表達(dá)或抑制miR-146a的表達(dá)水平，進(jìn)而利用ELISA法檢測IL-6和IL-8的表達(dá)水平，探討miR-146a對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8的調(diào)節(jié)作用。

方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)組：因暴露性角膜炎、壓迫性視神經(jīng)病變或限制性眼外肌病變行眼眶減壓術(shù)或斜視矯正術(shù)的甲狀腺相關(guān)眼病患者6例，術(shù)中取眼眶球后結(jié)締組織。

對照組：因眼外傷等原因引起眼球萎縮行眼球摘除術(shù)及義眼座植入術(shù)以及二期義眼座植入術(shù)6例，術(shù)中取眼眶球后結(jié)締組織。

1.慢病毒的構(gòu)建及慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細(xì)胞的條件

本實(shí)驗(yàn)需要的含目的基因的重組慢病毒載體由上?；鶆P基因公司協(xié)助構(gòu)建完成，根據(jù)上?；鶆P基因公司所提供的慢病毒感染實(shí)驗(yàn)手冊指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

2.轉(zhuǎn)染后ELISA檢測眼眶成纖維細(xì)胞Il-6和IL-8的表達(dá)水平

取生長良好的眼眶成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，各組眼眶成纖維細(xì)胞按4x104/ml接種6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集各組上清液，參照ELISA試劑盒使用說明，檢測細(xì)胞上清液中Il-6和IL-8的表達(dá)水平。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果轉(zhuǎn)染后ELISA檢測眼眶成纖維細(xì)胞Il-6和IL-8的表達(dá)水平

TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞較正常眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8水平明顯升高，結(jié)果與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞中，上調(diào)miR-146a表達(dá)水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同時(shí)，下調(diào)miR-146a表達(dá)水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。在正常人眼眶成纖維細(xì)胞，上調(diào)miR-146a表達(dá)水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;下調(diào)miR-146a表達(dá)水平，IL-8水平升高（P<0.05）。

討論

miR-146a是典型的多功能miRNA，參與免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞增殖，分化，凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)代謝和其他生命過程[7]。Sun等[8]通過qPCR比較甲狀腺相關(guān)眼病和非甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶脂肪組織中miR-146a的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)眼眶成纖維細(xì)胞中的炎性應(yīng)激能使miR-146a上調(diào)。楊文娟等[6]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺相關(guān)眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA-146a相對表達(dá)量較正常人明顯下降。然而，本實(shí)驗(yàn)研究TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞較正常眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8水平明顯升高。由此可見，在自身免疫性疾病中，miR-146a的表達(dá)可能有不同的復(fù)雜機(jī)制。

IL-6在甲狀腺相關(guān)眼病中也有重要的作用。已有研究表明，眼眶容量與IL-6mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，與IL-4mRNA、IL-10mRNA呈負(fù)相關(guān)[9]。相較于非活動性甲狀腺相關(guān)眼病患者，活動性甲狀腺相關(guān)眼病患者血清IL-6和可溶性型IL-6受體濃度明顯升高[3]。Ning等[10]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，甲狀腺相關(guān)眼病患者外周血的miR-146a的相對表達(dá)顯著增加，而Notch2的相對表達(dá)明顯降低，且 Notch2可以被miRNA-146a直接作為靶向目標(biāo)。外源性miRNA-146a模擬物可下調(diào)Notch2的表達(dá)和上調(diào)IL-6。抑制miRNA-146可以導(dǎo)致Notch2的表達(dá)升高和IL-6的表達(dá)降低。這些結(jié)果說明miR-146a可通過直接靶向作用Notch2增加IL-6水平，從而促進(jìn)甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)展。在我們的研究中，過表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，同時(shí)抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。

IL-8是促炎趨化因子，具有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞沿著血管壁的聚集的作用[11]。在甲狀腺相關(guān)眼病中，各種類型的成纖維細(xì)胞以及這些細(xì)胞中IL-8的大量產(chǎn)生參與疾病炎癥進(jìn)展[12]。在眼眶炎癥中，眼眶成纖維細(xì)胞在一些細(xì)胞因子的刺激下，如IL-1β、TNF-α、脂多糖和IFN-γ，產(chǎn)生劑量依賴的IL-8和MCP-1[13]。在我們的研究中，過表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-8的表達(dá)，同時(shí)抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-8的表達(dá)。

過表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)，抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)。提示miR-146a可能與甲狀腺相關(guān)眼病疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

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