蘇學旭，仲秀艷

（貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 1.心病內科，2.腦病內科，貴州 貴陽 550001）

心血管疾病是威脅我國國民生命健康的最主要的公共衛(wèi)生安全問題，尤其是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞喎Q冠心病）的發(fā)病率逐年上升，大大增加社會醫(yī)療負擔。心肌梗死（myocardial infarction,MI）屬于冠心病的危急重癥之一，在血流動力學、神經體液等因素綜合影響下，MI患者的心臟易發(fā)生結構重構、功能重構和電重構[1]。其最初表現為左心室?guī)缀涡螤罴敖Y構改變，并伴有心肌細胞肥大、心肌代償性肥厚，最終發(fā)生心力衰竭[2]。因此心室重構是MI進展式演變的主要病理機制之一，是患者致死和致殘的主要原因[3]。如何改善MI后心室重構、降低心力衰竭的發(fā)生率是MI二級預防亟待解決的重大難題。心肌缺血可觸發(fā)內質網應激（endoplasmic reticulum stress,ERS），適當的ERS可反饋性保護心肌缺血損傷，但是若心肌細胞長期存在嚴重的ERS，則可能會誘發(fā)細胞凋亡[4]。近年來，許多自擬方逐漸用于治療心力衰竭，并取得良好的臨床療效[5]。但是由于作用機制不明確，限制了中藥制劑在臨床上的應用。芪蛭三七湯是由貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院多個科室成員基于多年臨床經驗總結共同研制完成，主要成分包括黃芪、桂枝、水蛭、三七和冰片。芪蛭三七湯已應用于臨床，前期已有研究證實其療效顯著且安全可靠[6]。筆者通過對該經驗方的不斷完善，固定藥物劑量、精確工藝流程，擬通過本項研究在動物和細胞水平闡述芪蛭三七湯改善MI大鼠心室重構的分子機制，為現代醫(yī)學治療MI的研究提供新的思路?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

芪蛭三七湯由本院藥劑科根據中醫(yī)理論自行配制。配方為：黃芪 30 g，水蛭 10 g，三七 10 g，桂枝10 g，冰片0.1 g。水煎內服，濃縮至相當于原生藥材0.63 g/ml。

羥脯氨酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），葡萄糖調節(jié)蛋白 78（glucose regulated protein 78,GRP78）抗體、蛋白激酶R樣內質網激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK） 抗 體、p-PERK抗體、真核細胞翻譯起始因子2α（eukaryotictranslation initiation factor 2α,eIF2α） 抗 體、p-eIF2α 抗體及活化轉錄因子 4（activating transcription factor 4,ATF 4）抗體（美國Abcam公司），B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關 X 蛋白（bcl-2-associated X protein,Bax）抗體及 Caspase-3 抗體（美國 R & D Systems公司），RIPA 加強型細胞裂解液（美國Solarbio公司），3%戊巴比妥鈉由本院藥劑科提供，PCR引物由蘇州Genewiz生物科技有限公司合成并提供，BCA定量試劑盒、TUNEL試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），cDNA合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒及Taq DNA聚合酶（美國Omega公司），實驗用水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

小動物呼吸機（DW2000，上海嘉鵬科技有限公司），石蠟切片機（HM 340E，美國Thermo公司），PowerLab數據分析處理系統(tǒng)（澳大利亞AD instruments公司），實時定量PCR儀和iMake全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司），CX41光學倒置顯微鏡、熒光共聚焦顯微鏡及JEM-1400型透射電子顯微鏡（日本Olympus公司），Fluor Chem FC3 凝膠成像數碼分析系統(tǒng)（美國 Protein Simple公司）。

1.2 模型的復制、分組及干預方式

70只健康雄性SD大鼠，體重220～250 g，無特定病原體（SPF）級，購自上海睿太莫斯生物科技有限公司，許可證號：SCXK（滬）2016-0001，飼以無菌顆粒飼料，自由飲水；動物房溫度穩(wěn)定在（25±1）℃，相對濕度為40%～70%，12 h晝/夜交替照明。所有操作均符合動物倫理學要求。

采用冠狀動脈結扎法復制MI大鼠模型[7]。復制模型前，大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥40 ml/kg，將大鼠置于自制的實驗平臺上，固定四肢。縱向剖開氣管，插入小動物呼吸機，頻率維持70次/min，潮氣量為1.5～2.0 ml/100 g。術前描述Ⅱ導聯心電圖。在胸骨左緣3～4肋骨間開胸，充分暴露心臟。揭開心包膜和脂肪墊，暴露左心耳后，對兩組MI模型大鼠，采用7號縫合線在肺動脈圓錐和左心耳之間左冠狀動脈前降支處進行結扎，造成心肌缺血；而對假手術組大鼠，并未對冠狀動脈進行結扎，直接縫合關胸。采用心電圖監(jiān)測S-T段出現弓背樣抬高（＞0.2 mV）或T波高聳，肉眼見結扎周圍心肌組織呈暗紅色或灰白色，則顯示進行性心肌梗死模型復制成功。成功后大鼠自由活動和進食。

取模型復制成功大鼠，稱重，按照隨機數字表法分組，分組及干預方式如下：①空白對照組（n =15）：灌胃給予10 ml/（kg·d）無菌生理鹽水。②假手術對照組（假手術組）（n =14）：灌胃給予 10 ml/（kg·d）無菌生理鹽水。③MI模型對照組（MI組）（n =11）：灌胃給予10 ml/（kg·d）無菌生理鹽水。④芪蛭三七湯干預模型組（QZ組）（n =13）：灌胃給予22.68 g/（kg·d）（相當于2倍臨床等效劑量）芪蛭三七湯溶液。于模型復制后次日開始給藥，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.3 超聲心動圖

術后4周，稱量大鼠體重，大鼠吸入乙醚麻醉后，置于自制的實驗平臺上，固定四肢。采用小動物超聲儀獲取乳頭肌水平短軸切面，每組數據測量3次，取平均值。檢測左室舒張末徑（left ventricular enddiastolic dimension,LVEDd）、 左 室 收 縮 末 徑（left ventricular end-systolic dimension,LVESd）、左室射血分數（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左心室短軸縮短率（fractional shortening,FS）。

1.4 血流動力學指標

心功能檢測完畢后，分離大鼠右側頸總動脈，插入PE-50聚乙烯導管，連接PowerLab數據分析處理系統(tǒng)，記錄平均動脈壓（mean arterial pressure,MAP），進一步插入左心室，記錄左室壓上升最大速率（+dp/dtmax）和左室壓下降最大速率（-dp/dtmax）。每組數據測量3次，取平均值。

1.5 心肌梗死面積

將大鼠頸椎脫臼處死后，迅速取出心臟，放入預冷的生理鹽水中，灌洗心臟，從主動脈逆行注射伊文斯蘭，分離心房和心室，將心室置于含有2%瓊脂糖的培養(yǎng)皿中固定，切片后，避光置于復溫的、含有2%TTC磷酸緩沖液的棕色小瓶中孵育30 min。此時梗死區(qū)為灰白色，可判斷梗死心肌面積（area of necrosis,AN）；磚紅色為缺血非梗死區(qū)；而缺血區(qū)面積（area at risk,AAR）為灰白色和磚紅色之間的顏色區(qū)域；正常區(qū)域為藍色。將心臟組織置于4%多聚甲醛，采用Sigma Scan軟件計算梗死區(qū)域面積。梗死范圍以AN/AAR表示。每組數據測量3次，取平均值。

1.6 標本采集及處理

1.6.1 標本采集取出大鼠心臟后，取出心房和右心室，于結扎點下橫切2～3 mm，置于4%多聚甲醛溶液中固定5～7 d。然后生理鹽水清洗固定液，分別在60%、75%和90%的乙醇溶液中浸泡30 min，然后在100%乙醇Ⅰ中浸泡10 min，后在100%乙醇Ⅱ中浸泡20 min。采用石蠟包埋，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 HE染色 取心肌組織石蠟包埋塊，組織切片（3～4 μm），進行HE染色。首先將組織切片脫蠟，采用100%、90%、75%乙醇梯度脫水，滴加蘇木精染色5 min，沖洗3 s，滴加1%鹽酸乙醇分化，沖洗，滴加0.5%伊紅染色液染色3 min，沖洗，采用75%、90%、100%乙醇脫水，滴加松節(jié)油透明，中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察。

1.6.3 心肌細胞凋亡實驗取石蠟包埋塊，切片（3～4 μm）。采用TUNEL法，按照試劑盒說明書進行操作。每張切片于非梗死區(qū)域隨機選擇10個高倍鏡視野（×40），計數陽性染色細胞比例，比（%）表示凋亡指數（apoptosis index,AI）。每組數據測量 3 次，取平均值。

1.7 Western blotting檢測蛋白表達

①蛋白提?。喝〗Y扎線下左室后壁心肌組織約100 mg，加入預冷PBS，清洗3次；將組織剪碎后，加入1 ml預冷的蛋白裂解液，冰浴30 min，勻漿；離心，取上清液；采用BCA蛋白測定試劑盒說明書進行下一步操作。②蛋白變性：加入SDS上樣緩沖液充分混勻，置于95℃水浴中10 min，使蛋白變性，分裝，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。③Western blotting：將10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。將PVDF浸入密封液中，室溫密閉1 h。取出PVDF，采用TBST沖洗3次，分別加入GRP-78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4抗體（1∶500稀釋）或者凋亡相關蛋白抗體Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cytochrome C（1 ∶ 1 000 稀釋），置于4℃搖床上過夜。采用TBST沖洗3次，加入二抗，37℃孵育1 h，采用TBST沖洗3次；取適量的ECL試劑顯影5 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析凝膠光密度值。每組數據測量3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物存活狀態(tài)

由于麻醉、操作失誤、氣胸以及術后24 h內因死亡15只，術后24 h存活率為72.73%。假手術大鼠死亡1只，MI大鼠死亡14只，因此給藥前，假手術組有14只大鼠，MI組和QZ組各13只大鼠。給藥期間，QZ組、空白對照組和假手術組大鼠無死亡，而MI組于術后第10天和16天各死亡1只。

2.2 大鼠MI后心臟結構和功能變化

2.2.1 超聲心動圖評價術后4周，各組大鼠 LVEDd、LVESd、LVEF、FS水平比較，采用單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和假手術組大鼠比較，MI組大鼠LVEF和FS降低（P＜0.05），而 LVEDd、LVESd增加（P＜0.05），左室前壁變?。≒＜0.05）；但是與MI組大鼠比較，QZ組大鼠LVEF和FS均升高（P＜0.05），而LVEDd和LVESd均降低（P＜0.05）。見表1和圖1。

2.2.2 血流動力學指標術后4周，各組大鼠 +dp/dtmax和-dp/dtmax比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和假手術組大鼠比較，MI組大鼠 +dp/dtmax和 -dp/dtmax絕對值降低（P＜0.05）。但是與MI組大鼠比較，QZ組大鼠+dp/dtmax和-dp/dtmax絕對值升高（P＜0.05）。見表2。

2.2.3 梗死范圍比較術后4周，空白對照組和假手術組大鼠無梗死區(qū)域。MI組大鼠梗死范圍為（76.85±12.36）%，QZ組大鼠梗死范圍為（28.13±10.06）%，QZ組大鼠梗死范圍少于MI組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（t =10.652，P =0.000）。

表1 各組大鼠心功能情況（±s）

表1 各組大鼠心功能情況（±s）

注：①與空白對照組比較，P＜0.05；②與假手術組比較，P＜0.05；③與MI組比較，P＜0.05。

組別 n LVEDd/mm LVESd/mm LVEF/% FS/%空白對照組 15 7.51±0.44 3.54±0.32 83.36±1.37 53.92±1.45假手術組 14 7.49±0.50 3.51±0.28 84.05±1.72 54.43±1.80 MI組 11 10.35±0.79①② 9.06±0.65①② 30.75±8.58①② 15.78±8.69①②QZ組 13 8.76±0.71①②③ 7.12±0.58①②③ 67.86±10.93①②③ 38.54±11.56①②③F值 59.950 436.631 163.528 80.681 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組超聲心動圖

表2 各組大鼠血流動力學指標比較（mmHg/s，±s）

表2 各組大鼠血流動力學指標比較（mmHg/s，±s）

注：①與空白對照組比較，P＜0.05；②與假手術組比較，P＜0.05；③與 MI組比較，P＜0.05。

組別 n +dp/dtmax -dp/dtmax空白對照組 15 3 735.44±474.58 -3 037.51±379.45假手術組 14 3 811.86±512.79 -3 126.62±400.53 MI組 11 1 640.75±384.80①② -1 258.06±297.35①②QZ 組 13 3 023.26±435.86①②③ -2 485.13±447.39①②③F值 57.761 58.884 P值 0.000 0.000

2.2.4 心肌組織形態(tài)結構變化解剖各組大鼠心臟，空白對照組和假手術組大鼠心臟幾何形狀規(guī)整，心臟體積和心腔大小正常，顏色呈鮮紅色，彈性和韌性良好。與空白對照組和假手術組大鼠比較，MI組大鼠心肌組織失去原有的幾何形狀，體積增大，呈普大型；心腔擴大，呈暗紅色；彈性和韌性降低。另外，QZ組大鼠心臟也出現增大情況，顏色較假手術組偏深偏暗，但是與MI組大鼠比較，情況好轉。幾何形狀相對規(guī)整，彈性和韌性尚可。見圖2。

經HE染色后，光鏡下觀察可見空白對照組和假手術組心肌細胞呈多層整齊緊密排列，無水腫、壞死情況，心肌纖維排列緊密，呈束狀，橫紋肌清晰可見，無炎癥細胞浸潤。MI組可見心肌纖維腫脹、排列紊亂，甚至部分斷裂、溶解、消失，胞漿疏松，有大量炎癥細胞浸潤。而QZ組大鼠心肌組織雖然也出現肌纖維腫脹、炎癥細胞浸潤情況，但是較MI組減輕。見圖2。

2.2.5 心肌組織超微結構變化經透射電鏡觀察左室梗死周邊區(qū)心肌超微結構發(fā)現，與空白對照組和假手術組比較，MI組和QZ組MI周邊區(qū)有明顯的肌節(jié)長短不齊、肌絲斷裂溶解，線粒體的腫脹、空泡化，線粒體嵴減少改變。而QZ組未見肌絲斷裂，線粒體略腫脹，但結構基本正常，線粒體嵴可見，并能見到線粒體堆積和代償性增多現象。見圖3。

2.3 大鼠心肌細胞凋亡情況

2.3.1 各組大鼠非梗死區(qū)心肌AI情況 各組大鼠非梗死區(qū)心肌AI比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和假手術組比較，MI組大鼠非梗死區(qū)心肌AI較高（P＜0.05）。QZ組大鼠非梗死區(qū)心肌AI低于MI組大鼠（P＜0.05）。見表3。

2.3.2 各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達情況各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達量比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和假手術組大鼠心肌組織Bcl-2、Caspase-3、Bax蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。與空白對照組和假手術組比較，MI組大鼠心肌組織Caspase-3、Bax蛋白表達量升高，而Bcl-2蛋白表達量降低（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織Caspase-3、Bax蛋白表達量降低，Bcl-2蛋白表達量升高（P＜0.05）。見表3和圖4。

2.4 大鼠心肌組織內質網應激PERK-eIF2α信號通路相關蛋白表達情況

2.4.1 各組大鼠心肌組織GRP78 蛋白表達情況 各組大鼠GRP78蛋白表達量比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和假手術組比較，MI組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達量升高（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表4和圖5。

2.4.2 各組大鼠心肌組織PERK、eIF2α蛋白表達及磷酸化水平 各組大鼠心肌組織PERK和eIF2α蛋白表達量基本一致，采用單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），但p-PERK 和p-eIF2α 蛋白表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和假手術組比較，MI組大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達量升高（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表4和圖5。

2.4.3 各組大鼠心肌組織ATF4 蛋白表達情況 各組大鼠ATF4蛋白表達量比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和假手術組比較，MI組大鼠心肌組織ATF4蛋白表達量較高（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織ATF4蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表4和圖5。

圖2 各組大鼠心肌組織的形態(tài)結構

圖3 各組大鼠心肌組織的超微結構（×20 000）

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況（±s）

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況（±s）

注：①與空白對照組比較，P＜0.05；②與假手術組比較，P＜0.05；③與MI組比較，P＜0.05。

組別 n AI/% Caspase-3 Bcl-2 Bax空白對照組 15 7.84±3.19 0.65±0.15 1.28±0.17 0.52±0.12假手術組 14 9.55±4.32 0.67±0.12 1.21±0.18 0.49±0.11 MI組 11 49.35±14.67①② 1.36±0.34①② 1.10±0.28①② 0.72±0.23①②QZ組 13 23.96±11.78①②③ 0.89±0.28①②③ 1.26±0.12①②③ 0.56±0.09①②③F值 56.041 26.691 7.593 80.681 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 各組心肌細胞凋亡情況

表4 各組大鼠GRP78、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4蛋白表達量的比較（±s）

表4 各組大鼠GRP78、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4蛋白表達量的比較（±s）

注：①與空白對照組比較，P＜0.05；②與假手術組比較，P＜0.05；③與MI組比較，P＜0.05。

組別 n GRP78 p-PERK PERK p-eIF2α eIF2α ATF4空白對照組 15 0.75±0.09 0.36±0.09 1.26±0.17 0.28±0.07 0.77±0.12 0.52±0.09假手術組 14 0.74±0.12 0.37±0.10 1.28±0.20 0.27±0.04 0.72±0.10 0.50±0.12 MI組 11 1.51±0.28①② 0.56±0.15①② 1.24±0.18 0.47±0.06①② 0.77±0.15 1.05±0.16①②QZ組 13 1.13±0.21①②③ 0.44±0.10①②③ 1.21±0.18 0.35±0.05①② 0.76±0.06 0.63±0.15①②③F值 50.249 8.582 0.361 32.357 0.633 46.110 P值 0.000 0.000 0.783 0.000 0.596 0.000

圖5 各組內質網應激PERK-eIF2α信號通路相關蛋白的表達水平

3 討論

心室重構是MI發(fā)展為心力衰竭的基本病理過程。MI患者心臟因血流動力學改變、神經體液因素影響等，易發(fā)生結構和功能重構。臨床多表現為梗死區(qū)形成膠原瘢痕伴膨脹，肺梗死區(qū)域出現心肌肥厚、心室擴張以及心功能損傷等，是患者致死和致殘的主要原因[8]。在我國，MI后心室重構的發(fā)生率約為30%～50%[9]，進入本世紀以來，隨著再灌注治療的大力推廣和普及，大大降低MI患者的病死率，但是促使更多的MI患者進入心肌梗死后心室重構的階段。因此，如何減緩或逆轉MI后心室重構，降低心力衰竭的發(fā)生率，一直是心血管領域亟待解決的難題。

MI后心室重構在細胞水平的病理變化包括心肌細胞病理性肥大、心肌細胞凋亡或壞死、細胞外基質大量沉積等[10]。本項研究中，筆者通過結扎大鼠左冠狀動脈前降支造成心肌缺血性壞死，通過顯微鏡下組織形態(tài)觀察，MI模型組大鼠心肌組織失去原有的幾何形狀，體積增大，呈普大型；心腔擴大，呈暗紅色；彈性和韌性降低；心功能下降。經HE染色后，MI組大鼠心肌纖維腫脹、排列紊亂，甚至部分斷裂、溶解、消失，胞漿疏松，有大量炎癥細胞浸潤。除此以外，經伊文思藍和TTC雙染法證實MI大鼠心肌組織出現大面積梗死，且持續(xù)心肌缺血導致心肌細胞壞死和凋亡，心肌結構和心室構型同時發(fā)生相應變化，損傷心肌收縮-舒張功能，造成血流動力學障礙。主要表現為+dp/dtmax降低，-dp/dtmax升高，室壁順應性下降。從而從組織、細胞、分子水平多方面證實MI模型大鼠復制成功。而上述MI組大鼠心臟結構和功能發(fā)生的一系列變化經芪蛭三七湯干預4周后均有所改善。

近幾年本院在MI的病因病機、治則治法及復方組成研制等方面均取得突破性進展。其中芪蛭三七湯是本科室基于多年臨床經驗、結合中西醫(yī)理論總結的經驗方，且已用于臨床，并得到患者的普遍認可。該湯藥是由黃芪、桂枝、水蛭、三七、冰片組成。該方以黃芪和三七為君藥，可益氣以助血行，貫心脈而養(yǎng)五臟[11]。桂枝、水蛭為臣藥，既能夠益氣養(yǎng)陰，又可解毒化瘀，水蛭破瘀通絡臣，桂枝溫陽通脈，冰片開通心竅，引藥入絡為佐使，諸藥合參，共收益氣活血、破瘀通絡之功效，體現了以補為通，以通為補，通補兼施的特點。因此，在本項研究中，芪蛭三七湯可改善MI大鼠模型的心臟功能，但是其具體的作用成分和作用機制尚不明確。近幾年筆者通過對該方劑的不斷完善，固定藥物劑量、精準生產流程，最終獲得本實驗所用的芪蛭三七湯劑，筆者擬通過動物、細胞、分子水平探討中藥復方制劑芪蛭三七湯用于心肌梗死后心室重構的干預作用以及作用機制，為現代醫(yī)學闡釋MI后心室重構發(fā)生機制的研究以及藥物研發(fā)提供新的思路。

內質網是真核細胞儲存鈣離子、折疊修飾蛋白或脂質類物質的重要場所[12]。心肌梗死患者因心肌細胞發(fā)生缺血、缺氧性壞死，易導致內質網腔內未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白大量聚集以及鈣離子失衡，從而啟動細胞凋亡途徑[13]。在本研究中，經TUNEL法顯示，空白對照組和假手術組大鼠非梗死區(qū)心肌AI基本一致，MI組大鼠非梗死區(qū)心肌AI較空白對照組和假手術組有所升高，而經芪蛭三七湯干預后，大鼠非梗死區(qū)心肌AI低于MI組大鼠。筆者又進一步采用Western blotting法檢測各組大鼠心肌組織凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達，結果顯示，芪蛭三七湯可有效抑制MI大鼠周邊梗死區(qū)域細胞凋亡指數，同時降低心肌組織中促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達，提高抗細胞凋亡蛋白Bcl-2的表達量，可見芪蛭三七湯干預MI后心室重構的機制與抑制心肌細胞凋亡有關。

未折疊蛋白反應是內質網應激介導的一系列自我保護級聯反應，對修復細胞損傷、清理壞死細胞、維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定性十分重要[14]。靜息狀態(tài)下，內質網腔內未折疊蛋白通過與分子伴侶GRP78蛋白相結合而長期處于未激活狀態(tài)。GRP78蛋白屬于熱休克蛋白70家族成員之一，與蛋白的轉運、折疊、降解密切相關，其基因啟動子上含有特異性的內質網應激反應原件，正常情況下，可與PERK、ATF6、IRE1 3種跨膜蛋白相結合[15]。若內質網腔內蛋白折疊失敗而大量滯留，GRP78與這3種跨膜蛋白相解離，使其激活并觸發(fā)未折疊蛋白反應。因此GRP78激活通常被認為是內質網應激反應發(fā)生的標志[16]。在本項研究中，空白對照組和假手術組大鼠心肌組織內質網分子伴侶GRP78蛋白表達量基本一致，MI組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達量高于空白對照組和假手術組；QZ組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達量較MI組大鼠有所降低。提示芪蛭三七湯保護心肌細胞的分子機制可能與內質網應激反應有關。靜息狀態(tài)下，細胞中GRP78與PERK、ATF6、IRE1 3種蛋白結合處于未激活狀態(tài)，若內質網上聚集大量未折疊或錯誤折疊的蛋白，發(fā)生內質網應激反應，則可能引起PERK-eIF2α信號通路的激活[17]。PERK的主要作用是抑制錯誤折疊蛋白的合成和翻譯，發(fā)生內質網應激反應時，PERK脫離GRP78，促使eIF2α發(fā)生磷酸化，從而抑制其蛋白功能[18]。而磷酸化的eIF2α可促使ATF4發(fā)生轉錄翻譯，最終導致細胞凋亡[19]。在本項研究中，4組大鼠心肌組織PERK和eIF2α蛋白表達量基本一致，但與空白對照組和假手術組比較，MI組大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達量有所升高，而經芪蛭三七湯干預后，大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達量有所降低。說明MI后，大鼠心肌細胞內PERK含量并未增加，但是具有活性的p-PERK水平升高，p-PERK可促使eIF2α蛋白發(fā)生磷酸化。PERK-eIF2α通路進一步激活下游因子ATF-4促凋亡蛋白的表達，誘導細胞凋亡。由此推測在MI伴心室重構過程中，內質網應激尤其是PERK-eIF2α信號通路的高度活化，對心肌細胞具有嚴重損傷作用[20]。而芪蛭三七湯通過降低具有活性作用的p-PERK和p-eIF2α的表達水平，抑制心肌細胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護作用。

綜上所述，芪蛭三七湯經驗方可有效改善MI后大鼠的心功能，減輕不利的心室重塑。而其核心機制可能與抑制PERK-eIF2α信號通路誘導的內質網應激凋亡有關。