□ 馬曉娟 謝有發(fā) 余銀芳 李詒光（通訊作者） 江中藥業(yè)股份有限公司

枸杞是我國傳統(tǒng)的藥食同源性中藥藥材，性甘味平，滋補(bǔ)肝腎、益精明目[1]。枸杞原漿經(jīng)乳酸菌發(fā)酵不僅會產(chǎn)生豐富愉悅的風(fēng)味而讓消費(fèi)者更易接受，同時乳酸發(fā)酵帶來的益生作用也提高了枸杞的藥用保健價值，為枸杞類飲品市場擴(kuò)展了更大的開發(fā)空間。

枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）是一種水溶性蛋白多糖，其作為枸杞的重要活性成分，主要有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等生理作用[2-4]。中藥材中的一些多糖類物質(zhì)還具有一定的益生元功能——能夠促進(jìn)乳酸菌在腸道內(nèi)的增殖[5-7]，最終達(dá)到調(diào)節(jié)腸道菌群、減少腸道疾病發(fā)生的效果。目前，關(guān)于酵母發(fā)酵枸杞酒或乳酸發(fā)酵枸杞果蔬飲品的工藝報道較多，如楊梅枸杞酒[8]、枸杞藍(lán)莓酒[9]、石榴枸杞酒[10]等，陳萬更用乳酸菌發(fā)酵了枸杞綠茶[11]，徐婧君等用植物乳桿菌發(fā)酵果蔬奶（枸杞與胡蘿卜）[12]。但是，單純以枸杞進(jìn)行乳酸發(fā)酵的案例相對較少，且主要以工藝研究為主。許亮等[13]考察了枸杞果酒發(fā)酵過程中多糖先增大、后減小的變化規(guī)律，并最終維持在最低水平。本研究以發(fā)酵40h的枸杞原漿為檢測樣品，對不同發(fā)酵時間的原漿進(jìn)行枸杞多糖和活菌數(shù)的測定，考察枸杞多糖和活菌數(shù)在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，以期為枸杞原漿的乳酸發(fā)酵機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（市售寧夏中寧枸杞）；植物乳桿菌360（Lactobacillus plantarum），四川高福記生物科技有限公司；無水葡萄糖（食品級原料），山東保齡寶生物股份有限公司；D-無水葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品），中國藥品生物制品檢定所；硫酸、苯酚、95%乙醇、NaCl、MRS固體培養(yǎng)基成分等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HM-928料理機(jī)，廣州黑馬電器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4水浴鍋，常州國華電器有限公司；TD5M臺式低速離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計，SHIMADZU CORPORATION；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；320 pH Meter，METTLER TOLEDO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵工藝

1.3.1.1工藝流程

干枸杞→料液比1:6→浸提→打漿（添加5%葡萄糖）→滅菌（105℃、15min）→冷卻、接種（萬分之八）→發(fā)酵（37℃、40h）→成品→去籽、調(diào)配飲料。

1.3.1.2 工藝要點(diǎn)

原料處理：挑取顆粒均勻、飽滿的枸杞干果，用水沖洗兩次以去除表面的雜質(zhì)、灰塵等。

浸泡：以料水比1:6的比例，用溫水（40～50 ℃）浸泡枸杞至變軟。

打漿：將浸泡后的枸杞料液加入5%葡萄糖一起進(jìn)行打漿、破碎。

滅菌：在105℃下滅菌15min，滅菌時間不能過長，否則會破壞枸杞的色澤。

冷卻：采用自來水及時分段冷卻。

接種：采用植物乳桿菌菌劑進(jìn)行直投式接種，接種量為原漿重量的萬分之八，將稱好的菌劑溶于少量無菌水后投入原漿中。

發(fā)酵：在37℃下發(fā)酵40h，定期取樣。

1.3.2 pH值測定

采用pH計進(jìn)行測定，每隔4h取樣。

1.3.3 多糖測定

采用苯酚-硫酸法[1，14]進(jìn)行測定，每隔8h取樣。

1.3.3.1 對照品制備

葡萄糖（0.1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25mg，溶解后置于250mL容量瓶中定容。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0mL至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，然后加1mL5%苯酚溶液，搖勻后加入5mL濃硫酸（H2SO4）搖勻，靜置10min。將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min后在490nm下進(jìn)行紫外吸光度的測定。

1.3.3.3 供試樣品制備

取50mL發(fā)酵前后的原漿離心，取上清液3mL，加入30mL95%乙醇，醇沉20min后離心，4000r/min離心20min；棄去上清液，用85%乙醇進(jìn)行洗滌，最后加水定容至25mL；取200μL樣品測定吸光度。

1.3.3.4 樣品多糖測定

取200 μL樣品溶液至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，加5%苯酚溶液1mL，搖勻后加入濃硫酸（H2SO4）5mL再次搖勻，靜置10min；將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min；在490nm下進(jìn)行紫外吸光度的測定。

1.3.4 活菌數(shù)測定

采用平板（MRS固體培養(yǎng)基）稀釋法[15]，每隔4h取樣。

1.3.4.1 樣品處理

取發(fā)酵枸杞原漿1mL，加入至9mL無菌生理鹽水中，稀釋度為10-1樣液，按此方法依次將枸杞原漿稀釋到10-6、10-7樣液備用。

1.3.4.2乳酸菌計數(shù)

取稀釋度為10-6、10-7發(fā)酵枸杞原漿1000μL菌液涂布MRS固體培養(yǎng)基上，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，并記錄單菌落數(shù)，同時計算出活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中的pH變化

圖1 枸杞原漿在發(fā)酵過程中的pH值變化

枸杞原漿在發(fā)酵過程中的pH值動態(tài)變化如圖1所示。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵原漿的整體pH值呈下降趨勢——起始pH值為4.92，在0～8h之間下降不明顯，8～16h之間下降幅度最大，16h之后趨于平緩，發(fā)酵終點(diǎn)時pH值達(dá)到3.58。究其緣由，主要是因為枸杞原漿中的植物乳桿菌利用自身的酶類物質(zhì)、通過EMP途徑降解了枸杞原漿中的碳水化合物（如葡萄糖），進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)生了大量有機(jī)酸（以乳酸為主），增加了發(fā)酵原漿的酸度，降低了pH值。到終點(diǎn)時pH值得變化趨于平緩，主要是由于乳酸菌進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)生的酸有所減少。

圖2 枸杞原漿在發(fā)酵過程中的枸杞多糖變化

2.2 發(fā)酵過程中枸杞多糖的含量變化

以D-無水葡萄糖為對照品，以濃度C為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到回歸方程：C=0.0698A-0.0017、R2=0.9991，式中A為吸光度，C為枸杞多糖濃度（mg/L）。枸杞多糖在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化如圖2所示，整個發(fā)酵過程中枸杞多糖呈下降趨勢——發(fā)酵前多糖含量為2272.25mg/L，發(fā)酵終點(diǎn)時達(dá)到1271.78mg/L，減少了44.03%。在0～8h之間減速放緩，8～16h之間下降最快，16～40h下降緩慢至趨于平緩，這種趨勢同pH值的下降趨勢基本一致。發(fā)酵過程中出現(xiàn)的枸杞多糖變化可能是由于枸杞多糖作為益生元被植物乳桿菌吸收、利用，從而起到了增菌作用[16-17]；也可能因為枸杞多糖是一種含少量蛋白質(zhì)的多糖復(fù)合物[18-19]，植物乳桿菌利用枸杞多糖作為碳源或植物乳桿菌產(chǎn)生的酶將其降解[20]，生成了小分子物質(zhì)，致使多糖含量降低。而在發(fā)酵前期，植物乳桿菌優(yōu)先利用單糖葡萄糖，后期轉(zhuǎn)為利用多糖。

2.3 發(fā)酵過程中乳酸菌的活菌數(shù)變化

植物乳桿菌的活菌數(shù)在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化如圖3所示，活菌數(shù)隨發(fā)酵時間的增加先升高后降低，生長趨勢與束文秀等[21]研究中乳酸菌的生長趨勢一致。在0～16h植物乳桿菌的生長速度較快，呈現(xiàn)上升趨勢；4h之前緩慢增長，在12h時接近達(dá)到了最高點(diǎn)，活菌數(shù)為6.84×109cfu/mL；12～28h時生長平緩，處于穩(wěn)定期；28h之后下降明顯。究其緣由，主要是由于發(fā)酵原漿中碳源等營養(yǎng)物質(zhì)的減少和代謝產(chǎn)物尤其是酸的產(chǎn)生影響了乳酸菌的生長。整個發(fā)酵過程中，活菌數(shù)均處于108cfu/mL以上，說明枸杞對植物乳桿菌的生長有促進(jìn)作用。

圖3 枸杞原漿在發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化

3 結(jié)論與討論

本研究考察了枸杞原漿在發(fā)酵過程中pH值、枸杞多糖和活菌數(shù)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，發(fā)酵過程中，pH值和枸杞多糖呈現(xiàn)下降趨勢，活菌數(shù)先上升后下降，最終pH值達(dá)到3.58、枸杞多糖含量達(dá)1271.78mg/L、植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)2.57×109cfu/mL。如果將發(fā)酵好的枸杞原漿稀釋100 倍調(diào)配成枸杞飲料，其活菌數(shù)仍可達(dá)到≥106cfu/mL的乳酸菌活菌飲品標(biāo)準(zhǔn)[22]。

本研究中，枸杞多糖減少的結(jié)果不同于許亮[13]研究的枸杞果酒中枸杞多糖先增加后減少的結(jié)果，這種差別可能由于菌種和發(fā)酵條件不同所引起。枸杞多糖的減少反映出植物乳桿菌的代謝對枸杞有一定的作用或影響，其可能被消耗或降解為其他更容易被人體吸收的物質(zhì)。李越鯤[23]研究的枸杞多糖經(jīng)超聲波降解LBP-s水溶性增強(qiáng)，體外抗氧化活性高于粗多糖，說明多糖降解后也可以發(fā)揮出更好的作用。此外，枸杞多糖也可作為益生元對乳酸菌起到增殖作用。從益生菌對人體有益健康的角度開發(fā)產(chǎn)品，在益生菌類產(chǎn)品中添加枸杞多糖等中藥提取物，通過增強(qiáng)益生菌與多糖的協(xié)同作用更利于產(chǎn)品的銷售和消費(fèi)者的青睞。但是發(fā)酵過程中枸杞多糖的變化機(jī)制和具體原因尚未得出明確結(jié)論，需在進(jìn)一步的研究中進(jìn)行探討。