□ 馬慧娟 江蘇省理化測(cè)試中心

牛肉及其制品因其營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛。不法商販用相對(duì)廉價(jià)的馬肉、豬肉、鴨肉等肉類原料，通過各種手段加工，冒充牛肉、羊肉制品進(jìn)行銷售以謀取不當(dāng)利益，從而嚴(yán)重侵犯消費(fèi)者的合法權(quán)益。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( polymerase chain reaction，PCR) 是一種使特定核酸片段在體外大量復(fù)制的技術(shù)，利用這一技術(shù)，可以讓目標(biāo)物種的特異DNA片段進(jìn)行大量復(fù)制而進(jìn)行檢測(cè)，以鑒別肉制品中是否摻入其他物種。相比于其他檢測(cè)手段，PCR檢測(cè)技術(shù)具有特異性好，靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，可以準(zhǔn)確地為政府監(jiān)管提供有利證據(jù)。本文對(duì)在各大菜市場(chǎng)和超市購(gòu)買的牛肉及其制品中牛、豬、鴨成分進(jìn)行了檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)對(duì)鮮牛肉的清洗樣和血水進(jìn)行取樣檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了結(jié)果分析和總結(jié)，為摻假牛肉檢測(cè)技術(shù)提供理論和技術(shù)支撐，提高檢測(cè)人員對(duì)肉類檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)和分析能力。

材料與方法

材料與試劑

鮮牛肉，牛肉制品均購(gòu)自于南京市各大菜市場(chǎng)和超市。

DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0 、Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit、Real Time PCR Procine DNA Detection Kit、TaKaRa Taq（5U/uL）、10×PCR Buffer（Mg2+ plus）、dNTP Mixture（各2.5 mM）、PCR體系預(yù)混液Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）寶生物工程（大連）有限公司。

儀器和設(shè)備

PikoREAL 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（96孔板）：美國(guó)賽默飛；ST 16R高速冷凍離心機(jī)：美國(guó) 賽 默 飛；EPS 300電 泳 儀 Tanon；Universal GenoSens1800凝膠成像儀：上海勤翔；ABI 2720普通PCR儀。

DNA提取

對(duì)每個(gè)鮮牛肉樣品按照不同的部位和步驟取樣，分別取原樣，清洗樣（盡量取肉的中心位置，用自來水反復(fù)清洗），血水（浸出到包裝袋里的血水），對(duì)采得的樣品進(jìn)行DNA提取，其中血水的DNA提取稱樣量為100mg。對(duì)牛肉卷等牛肉加工樣品直接取原樣進(jìn)行DNA提取。DNA的提取均采用試劑盒的說明書方法步驟進(jìn)行。

熒光定量PCR檢測(cè)

牛和豬的PCR反應(yīng)體系均為：預(yù)混液20 μL，包 括 DNA 模 板 0.8μL，2×Premix for Bovine（ Procine）10 μL，Primer Mix for Bovine（ Procine）0.8 μL，Probe Mix for Bovine（Procine）0.8μL，加 ddH2O 補(bǔ)足 20μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 s；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線Ct值≤35.0視為檢出牛或豬成分。

鴨的PCR反應(yīng)體系為：預(yù)混液20 μL，包括 DNA模 板 1.6 uL，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10 uL，上下游引物各0.4 uL，Probe 0.8 uL，加ddH2O補(bǔ)足20uL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 30 s；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線Ct值≤35視為檢出鴨成分。

結(jié)果與分析

對(duì)各大超市和菜市場(chǎng)購(gòu)買的50批次鮮牛肉及牛肉制品等樣品進(jìn)行牛、豬、鴨成分檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1。

由圖1可以看出，純牛肉為36例，占總數(shù)的72%。發(fā)現(xiàn)一例牛肉摻鴨肉，摻假肉占2%。牛肉中摻有豬血的樣品占6%，牛血不易采集，價(jià)格貴，且牛血味道難聞，不法商販為了增加牛肉的重量而使用豬血浸泡牛肉，以獲取更高的利潤(rùn)。發(fā)現(xiàn)假肉為10例，且均為豬肉造假牛肉。其中純豬肉為3例，占總數(shù)的6%，豬肉之所以能華麗變身為“牛肉”，其中起最大作用的并不是“硼砂”，而是豬血，將事先準(zhǔn)備好的豬血、豆粉、糖、鹽等混入已經(jīng)絞碎成片的豬肉中攪拌，同時(shí)加入硼砂，經(jīng)過均勻攪拌后，正規(guī)的豬肉就被加工成了外觀顏色鮮紅的“牛肉”；豬肉中摻牛血數(shù)量為7例，占14%，用牛血浸泡豬肉，從鮮肉外觀上聞和看都會(huì)造成是牛肉的假象。

圖1 牛肉摻假種類及數(shù)量結(jié)果

結(jié)論

本文對(duì)樣品的原樣、清洗樣（用自來水清洗）、血水進(jìn)行取樣并提取DNA，檢測(cè)牛、豬、鴨三種成分，發(fā)現(xiàn)摻假情況多種多樣，有牛肉摻鴨肉，牛肉摻豬血，純豬肉，豬肉摻牛肉等摻假及造假情況，其中摻假率為2%，造假率為20%。在檢測(cè)過程中對(duì)樣品進(jìn)行清洗，可以洗掉浸泡在肉組織中的血水，只對(duì)肉組織進(jìn)行取樣分析，防止不法商販為了造假牛肉而用豬肉浸泡牛血冒充牛肉，對(duì)血水進(jìn)行提取DNA檢測(cè)也是此目的。本文只是對(duì)日常過程中遇到的摻假案例進(jìn)行了分析總結(jié)，在以后的工作中應(yīng)多方面關(guān)注肉類摻假信息，提高物種鑒定技術(shù)，同時(shí)在檢測(cè)過程中，對(duì)樣品的取樣應(yīng)觀察肉樣是否是整塊肉。如果不是整塊肉，應(yīng)均勻取樣，且取樣品的紅肉部分；如果肉樣是整塊肉，則應(yīng)取肉樣的中間部位，并進(jìn)行多次清洗，把血水洗干凈，減少因血液浸泡而引起的誤判。