覃斐章 秦秋華

[摘要] 目的 觀察玉郎傘查爾酮（YLSC）對大鼠心肌缺血再灌注后炎性反應(yīng)的影響。 方法 將60只12周齡的SPF級SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（等體積生理鹽水），模型組（等體積生理鹽水），陽性組（葛根素注射液12.00 mg/kg），YLSC低劑量組（2.50 mg/kg）、中劑量組（YLSC 5.00 mg/kg）和高劑量組（YLSC 10.00 mg/kg），每組10只，雌雄各半。缺血1 h再灌注3 h復(fù)制大鼠缺血再灌注模型。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清MB型肌酸激酶（CK-MB）、肌鈣蛋白（cTnI）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。伊文思藍(lán)和2，3，5-三苯基氯化四氮唑雙重染色確定心肌梗死面積。Western blot法檢測心肌高遷移率族蛋白1（HMGB1）、Toll樣受體4（TLR4）和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）。 結(jié)果 與模型組比較，YLSC能減少心肌酶CK-MB、cTnI的漏出（P < 0.05或P < 0.01），縮小心肌梗死面積（P < 0.05或P < 0.01），降低血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的釋放（P < 0.05或P < 0.01），并抑制心肌HMGB1、TLR4、NF-κB的蛋白表達（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 YLSC能減少大鼠缺血再灌注損傷，其心肌保護作用可能與減輕炎性反應(yīng)，抑制心肌HMGB1、TLR4、NF-κB的蛋白表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 玉郎傘查爾酮;心肌缺血再灌注;高遷移率族蛋白1;炎性反應(yīng)

[中圖分類號] R542.22? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（b）-0013-05

Effects of 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone on inflammatory responses in myocardial ischemia reperfusion injury in rats

QIN Feizhang1? ?QIN Qiuhua2

1.Department of Pharmacology， College of Pharmacy， Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning? ?530021，China; 2.Department of Pharmacy， Nanning Second People's Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning? ?530031， China

[Abstract] Objective To observe the effects of 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone （YLSC） on inflammatory responses in myocardial ischemia reperfusion injury in rats. Methods Sixty 12-month-old SPF Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into sham group （equal volume of normal saline）， model group （equal volume of normal saline）， positive control group （Puerarin Injection， 12.00 mg/kg） and YLSC low， medium and high-dose groups （2.50， 5.00， 10.00 mg/kg） via random number table method. The anterior descending coronary artery was ligated for 1 h then reperfused for 3 h to establish the ischemia reperfusion （I/R） model. Rats in sham group were applied stitches under the coronary artery without ligation. Levels of serum troponin I （cTnI）， creatine kinase-MB （CK-MB）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were examined by enzyme-linked immunosorbent assay. The infarct sizes were measured by evans blue and 2， 3， 5-triphenyltetrazolium chloride staining. Protein levels of high mobility group box-1（HMGB1）， toll-like receptors 4 （TLR4） and nuclear factor-kappa B （NF-κB） in myocardiums were evaluated using Western blot. Results Compared with model group， YLSC reduced the leakage of myocardial enzyme CK-MB and cTnI （P < 0.05 or P < 0.01）， decreased myocardial infarction size （P < 0.05 or P < 0.01）， lower the release of serum inflammatory cytokines such as IL-6， IL-1β and TNF-α （P < 0.05 or P < 0.01）， and inhibited the protein expression of myocardial HMGB1， TLR4， NF-κB （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion YLSC can reduce ischemia-reperfusion injury in rats， the myocardial protective effect may be related to reducing of inflammatory reaction， inhibiting the expression of myocardial related protein such as HMGB1， TLR4 and NF-κB.

[Key words] 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone; Ischemia and reperfusion injury; High mobility group box-1; Inflammatory responses

缺血心肌恢復(fù)血流后組織功能代謝障礙，結(jié)構(gòu)進一步破壞，甚至發(fā)生不可逆性損傷，稱之為心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷。IR機制復(fù)雜，其中細(xì)胞因子和炎癥因子的大量釋放起著重要的作用[1-3]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB1）是一種晚期致炎因子，可能參與了多種組織器官如心、腦、腎的IR進程。HMGB1促進細(xì)胞因子的趨化和游走，同時調(diào)控了很多編碼細(xì)胞因子的基因[4]，由于其具有作用持久的特點，針對HMGB1的治療比其他早期炎癥因子具有更寬泛的治療窗口期。

玉郎傘系豆科植物疏葉崖豆[Millettia pulchra（Dunn）Kurzvar.Laxior（Dunn）Z.Wei]的干燥根，為廣西壯、瑤醫(yī)常用藥材，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)腫痛、中風(fēng)偏癱，骨折及產(chǎn)后虛弱等[5]。17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮（17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone），簡稱“玉郎傘查爾酮”（YLSC），是從玉郎傘中提取的黃酮類化合物[6]。筆者前期的研究表明YLSC具有抗氧化、減少鈣超載和抗血小板聚集作用[7];筆者近期實驗尚發(fā)現(xiàn)，YLSC能抑制細(xì)胞凋亡，顯著下調(diào)NF-κB p65和Bax蛋白表達[8]，提示玉郎傘查爾酮抗IR的作用機制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，但作用機制并未完全清楚。葛根素臨床上用于心肌梗死、冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療，有較好的療效。有研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可減少缺血心肌中血清C反應(yīng)蛋白的釋放，升高NO[9]，并通過核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路抑制IR心肌細(xì)胞的損傷[10]。據(jù)此，本試驗選擇葛根素作為陽性對照藥，以評價YLSC對大鼠心肌IR損傷后炎性反應(yīng)的影響，為藥物的進一步研發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

70只12周齡SPF級斯普拉格-杜勒鼠（Sprague-Dawley，SD）大鼠，雌雄不限，體重250～300 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。試驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2014-0003，試驗動物使用許可證SYXK桂2014-0004。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±3）℃，相對濕度為50%～70%，12 h明暗交替，可以自由進食。

1.2 藥物與試劑

玉郎傘采自廣西壯族自治區(qū)靈山縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定是蝶形花科植物疏葉崖豆Millettia pulchra var.Laxior的塊根。YLSC由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供，將玉郎傘飲片用60%乙醇進行微波輔助提取，萃取液濃縮得醋酸乙酯部位，采用多級柱層板、反復(fù)三氯甲烷-甲醇重結(jié)晶、制備液相色譜法對此部位進行純化得到Y(jié)LSC單體，高效液相色譜法檢測純度為98%[6];葛根素注射液由山東華信制藥集團股份有限公司生產(chǎn)（規(guī)格：2 mL/0.1 g，批號：081003）;大鼠MB型肌酸激酶（CK-MB）、肌鈣蛋白（cTnI）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測試試劑盒均購自北京北方生物技術(shù)研究所（批號：070152、18140506、201802137、201803241、017904）;抗HMGB1、抗Toll樣受體4（TLR4）、抗NF-кB抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司（批號：T1784、3869M、S7806）;IgG-HRP、Immobilon-P試劑盒購自Pierce公司（批號：PN353820、SP562309）。

1.3 儀器

動物呼吸機器（上海奧爾科特生物科技有限公司）;722 s可見光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）;Western電泳儀（美國Bio-Rad）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與給藥方式? 采用隨機數(shù)字表法將60只雌雄各半的SD大鼠隨機分為6組（每組10只）：①假手術(shù)組（生理鹽水）;②模型組（生理鹽水）;③陽性組（葛根素注射液，12.00 mg/kg）;④YLSC低劑量組（YLSC 2.50 mg/kg）;⑤YLSC中劑量組（YLSC 5.00 mg/kg）;⑥YLSC高劑量組（YLSC 10.00 mg/kg）。各組均按2 mL/kg體重尾靜脈給予相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)14 d。第14天給藥后10 min復(fù)制大鼠IR模型。

1.4.2 建立大鼠IR模型? 用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，仰位固定于鼠板上。行氣管插管，連接小動物呼吸機，設(shè)置參數(shù)為呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶2，潮氣量50 mL/kg。自胸骨左側(cè)第4肋間開胸，剪破心包膜，暴露心臟，用5-0號縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支（結(jié)扎線上連接PE10聚乙烯管）。缺血1 h后，剪開結(jié)扎線，取出聚乙烯管，再灌注3 h復(fù)制大鼠IR模型。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。以缺血時ST段抬高，再灌注時ST段下降>50%為造模成功標(biāo)志[10]。

1.4.3 血清CK-MB、cTnI、IL-6、IL-1β、TNF-α濃度的測定? 實驗結(jié)束后腹主動脈取血，室溫靜置2 h后置于離心機中以轉(zhuǎn)速4000 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min，吸取上清液并存儲于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yán)格按照試劑盒說明書，用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清CK-MB、cTnI、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.4.4 心肌梗死面積的測定? 再灌注結(jié)束后再次結(jié)扎冠狀動脈左前降支，于主動脈根部注射3%的伊文斯藍(lán)2 mL，待心臟染色均勻后迅速摘除心臟。沿房室溝將心臟切片，每片厚約2 mm。切片置于1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）中37℃孵育15 min，梗死心肌組織不染色呈白色，正常心肌組織染成藍(lán)色，缺血心肌組織染成磚紅色。用Image J軟件測量并計算梗死區(qū)總面積（infarct sizes，IS）占缺血區(qū)總面積（area at risk，AAR）的百分比（IS/AAR）。

1.4.5 Western blot法檢測心肌HMGB1、TLR4、NF-кB的蛋白表達? 取40 μg心肌組織蛋白樣品，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯膜上，加入相應(yīng)稀釋倍數(shù)的一抗（HMGB1、TLR4、NF-κB的抗體體積比分別為1∶1000、1∶2000、1∶500），4℃孵育過夜。然后加入相應(yīng)的二抗孵育1 h。用Image Lab軟件分析蛋白條帶的光密度值，以目的條帶的光密度值/內(nèi)參GAPDH的光密度值作為蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌IR模型

取70只SD大鼠制備心肌IR模型，其中6只結(jié)扎后發(fā)生心律失常死亡，2只結(jié)扎后心電圖J點升高不明顯，2只大出血死亡。剩余60只大鼠符合實驗要求，用于后續(xù)實驗，造模成功率為85.7%。

2.2 YLSC對大鼠血清CK-MB、cTnI含量和心肌梗死面積的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK-MB、cTnI的含量顯著升高（P < 0.01），IS/AAR增加（P < 0.01）;與模型組比較，陽性組和YLSC低、中、高劑量組大鼠心肌CK-MB、cTnI均減少（P < 0.05或P < 0.01），IS/AAR均縮?。≒ < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.3 YLSC對大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯增高（P < 0.01）;與模型組比較，陽性組和YLSC低、中、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.4 YLSC對大鼠心肌HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中HMGB1、TLR-4和NF-κB的表達量明顯增高（P < 0.01）;與模型組比較，陽性組和YLSC中、高劑量組心肌組織中HMGB1、TLR4和NF-κB的蛋白表達量明顯減少（P < 0.05或 P < 0.01）。見表3、圖2。

3 討論

心肌IR機制復(fù)雜，炎性反應(yīng)起著關(guān)鍵的作用[11]。近期研究發(fā)現(xiàn)[12]，前炎癥因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、ICAM-1等在心肌IR時表達會突然增加，而采取治療措施減少前炎癥因子的釋放后，心肌細(xì)胞的損傷明顯減輕。本研究觀察到，相對于模型組，YLSC組能顯著降低血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，且YLSC中、高劑量組更明顯，提示YLSC具有減少促炎因子表達的作用。

HMGB1是普遍存在于哺乳動物組織細(xì)胞中的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。HMGB1作為重要的內(nèi)源性因子參與IR炎性反應(yīng)[12-13]。大鼠IR實驗中觀察到，HMGB1于缺血后30 min升高，再灌注后30 min達高峰，并持續(xù)到再灌注后48 h[14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可在急性心肌梗死（AMI）發(fā)生后迅速從細(xì)胞內(nèi)釋放，12 h達到高峰，并維持至AMI發(fā)生后7 d，提示HMGB1可作為AMI預(yù)測、療效觀察和和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[15]。近年來多項研究證實，通過抑制HMGB1的表達，可以減輕心肌IR的發(fā)生。Andrassy等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IR前給予重組的HMGB1能增加心肌梗死面積，提高心肌TNF-α、IL-6含量，而HMGB1拮抗劑Box A則能減輕心肌IR損傷。HMGB1中和抗體和一些化合物（如丁酸鈉[17]、右美托咪啶[18]、胡黃連苷Ⅱ[19]等）也可以通過減少HMGB1的表達減輕炎性反應(yīng)。抑制HMGB1的合成和釋放可能是調(diào)控心肌IR損傷的一個潛在的治療靶點。

Toll-like receptors（TLRs）受體是HMGB1的主要受體之一。TLRs有11種亞型，其中TLR4在心臟的分布密度最高[20]。HMGB1可與細(xì)胞膜表面的TLR4受體配型相結(jié)合，通過TLR4-MyD88依賴性途徑或TLR4-TRIF途徑激活NF-κB，促進其轉(zhuǎn)錄入細(xì)胞核內(nèi)，進一步促進TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、ICAM和β干擾素等炎癥因子的活化和合成。而上述因子又反過來促進HMGB1的大量釋放，使炎性反應(yīng)失控，形成瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加速心肌損傷[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，YLSC預(yù)處理明顯降低心肌組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白含量。說明YLSC可以通過抑制HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白的表達，減輕心肌IR損傷的炎性反應(yīng)，發(fā)揮心肌保護作用。

綜上所述，YLSC能減少心肌酶的漏出，縮小心肌梗死面積，減輕心肌IR時的炎性反應(yīng)，起到心肌保護作用，其機制可能與抑制心肌HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達，降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α濃度有關(guān)。

[參考文獻]

[1]? 蔡銀鏈，許朝祥，王耀國，等.白藜蘆醇通過抑制TNF-α的釋放緩解大鼠缺血再灌注心臟損傷[J].免疫學(xué)雜志，2018，34（11）：934-939.

[2]? 黃婷，李紹旦，李涵，等.通心絡(luò)干預(yù)肥大細(xì)胞脫顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對缺血再灌注心肌的保護機制[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15（23）：2973-2976.

[3]? 陳福暉，劉達，興容松.心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機制的研究進展[J].安徽醫(yī)藥，2017，21（12）：2145-2148.

[4]? 趙麗華，尹宏磊，呂風(fēng)華，等.HMGB1對缺氧復(fù)氧環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡的影響及機制研究[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2018， 25（6）：746-750.

[5]? 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992：31-32.

[6]? 簡潔，張士軍，邱莉，等.壯藥玉郎傘查爾酮類成分的研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（20）：1734-1737.

[7]? 覃斐章，簡潔，林興，等.17-甲氧基7-羥基-苯并呋喃查爾酮對大鼠凝血功能和血小板聚集的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（13）：197-200.

[8]? Jie J，Qing FZ，Zhang SJ，et al. The effect of 17-Methoxyl-7-hydroxy-benzene-furanchalcone isolated from Millettia Pulchra on myocardial ischemia in vitro and in vivo [J]. Planta Medica，2012，78（12）：1324-1331.

[9]? 柳挺.葛根素對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清CRP、NO和CK含量的影響[J].中醫(yī)臨床研究，2018，10（28）：12-13.

[10]? 周英，朱瀅，楊建宇.葛根素通過核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷的機制研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2016，32（8）：700-701.

[11]? 黃丹，段鈺萍，王學(xué)東，等.丹參川芎嗪注射液對嚴(yán)重創(chuàng)傷患者炎性因子影響及預(yù)防膿毒癥效果[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，26（10）：1069-1071.

[12]? Xu X，Liang T，Lin X，et al. Effect of the Total Extract of Averrhoacarambola（Oxalidaceae） Root on the Expression Levels of TLR4 and NF-κB in Streptozotocin-Induced Diabetic Mice [J]. Cell Physiol Biochem，2015，36（6）：2307-2316.

[13]? Scaffidi P，Misteli T，Marco E，et al. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation [J]. Nature，2002，418：191-195.

[14]? 林運靈.高遷移率族蛋白1在大鼠缺血再灌注損傷中的作用及丙酮酸乙酯的療效[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2010.

[15]? Kohno T，Anzai T，Naito K，et al. Role of high-mobility group box 1 protein in post-infarction healing process and left ventricular remodeling [J]. Cardiovasc Res，2009， 81（3）：565-573.

[16]? Andrassy M，Volz HC，Igwe JC，et al. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart [J]. Circulation，2008，117（25）：3216-3226.

[17]? Hu X，Zhang K，Xu C，et al. Anti-inflammatory effect of sodium butyrate preconditioning during myocardial ischemia/reperfusion [J]. Exp Ther Med，2014，8（1）：229-232.

[18]? Zhang JJ，Peng K，Zhang J，et al. Dexmedetomidine preconditioning may attenuate myocardial ischemia/reperfusion injury by down-regulating the HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB signaling pathway [J]. PLoS One，2017， 12（2）：1-15.

[19]? Li JZ，Xie MQ，Mo D，et al. Picroside Ⅱ protects myocardium from ischemia/reperfusion-induced injury through inhibition of the inflammatory response [J]. Exp Ther Med，2016，12（6）：3507-3514.

[20]? Frantz S，Kobzik L，Kim YD，et al. Toll4（TLR4） expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium [J]. J Clin Invest，1999，104（3）：271-280.