麻楠，喬金柱，湯文倩，孫天杰，劉娜，陳琰，路興通，韓勝芳，王冬梅

小麥翻譯控制腫瘤蛋白TCTP與蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK1的相互作用

麻楠，喬金柱，湯文倩，孫天杰，劉娜，陳琰，路興通，韓勝芳，王冬梅

河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001

翻譯控制腫瘤蛋白 (Translationally controlled tumor protein, TCTP) 廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、植物生長(zhǎng)發(fā)育，并介導(dǎo)植物抵御病原物侵染。蔗糖非酵解型蛋白激酶 (SNF1- related protein kinase, SnRK1)在酵母、動(dòng)物和植物中非常保守，并參與包括糖代謝和抵抗非生物和生物脅迫在內(nèi)的一系列生理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)室前期工作證明TaTCTP響應(yīng)葉銹菌侵染并參與誘發(fā)寄主產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)。為了深入探討TaTCTP在葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮的作用，采用串聯(lián)親和純化 (TAP) 與質(zhì)譜 (MS) 聯(lián)用技術(shù)，鑒定出SnRK1可能為T(mén)aTCTP潛在互作蛋白。文中對(duì)TCTP和SnRK1的相互作用進(jìn)行了研究。酵母雙雜交結(jié)果表明，同時(shí)攜帶TCTP和SnRK1的酵母可以在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (SD/-LWHA, 四缺) 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明TCTP與SnRK1在酵母雙雜交系統(tǒng)中可以發(fā)生相互作用；通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TCTP與SnRK1發(fā)生相互作用的熒光信號(hào)分布在細(xì)胞質(zhì)中；進(jìn)一步用Co-IP實(shí)驗(yàn)證明TCTP和SnRK1可以發(fā)生相互作用。本研究為深入研究TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步完善小麥抵御葉銹菌侵染的分子機(jī)理具有重要意義。

翻譯控制腫瘤蛋白，蔗糖非酵解型蛋白激酶，酵母雙雜交，雙分子熒光互補(bǔ)，免疫共沉淀

翻譯控制腫瘤蛋白是一類保守且廣泛存在于真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)[1]。自1981年從小鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并鑒定以來(lái)[2]，TCTP被認(rèn)為具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抑制細(xì)胞凋亡[3]、參與組胺的釋放[4]、調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞分化[5]、參與修復(fù)DNA損傷[6]等。在植物中，TCTP影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]、響應(yīng)乙烯信號(hào)[8]、降低重金屬汞誘導(dǎo)的活性氧 (ROS) 對(duì)組織的傷害[9]。此外，有報(bào)道指出，TCTP響應(yīng)胡椒黃花葉病毒PepYMV的侵染[10]、小麥白粉菌的侵染[11-12]和小麥葉銹菌的侵染[13]，說(shuō)明TCTP在植物與病原菌互作過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，小麥在其生長(zhǎng)周期常受到多方不利因素的影響，其中，由小麥葉銹菌侵染引起的小麥葉銹病是危害小麥生產(chǎn)的嚴(yán)重病害。已有報(bào)道，在小麥抵御條銹菌侵染的過(guò)程中TCTP發(fā)揮重要作用，采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默 (Virus induced gene silencing, VIGS) 技術(shù)沉默小麥中的，很大程度地降低了植株對(duì)條銹菌的抗性[14]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，在由小麥抗葉銹近等基因系Tc和葉銹菌生理小種366組成的不親和組合中，的轉(zhuǎn)錄水平在測(cè)定范圍內(nèi)隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，但其在蛋白水平并無(wú)明顯變化[13]。為了進(jìn)一步研究TCTP在小麥抵御葉銹菌侵染誘發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程中的作用機(jī)制，完善植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，本課題組前期借助串聯(lián)親和純化-質(zhì)譜鑒定 (TAP-MS) 技術(shù)，建立了TCTP在小麥-葉銹菌互作過(guò)程中的潛在互作蛋白庫(kù)，從中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與TCTP潛在互作的蛋白即蔗糖非酵解型蛋白激酶1 (SNF1- related protein kinase, SnRK1)。

SnRK最先發(fā)現(xiàn)于酵母中，由于缺失該基因的酵母突變體不能夠利用無(wú)葡萄糖培養(yǎng)基中的甘油和乙醇等碳源，故該突變體命名為(Sucrose non-fermenting 1)[15]。在動(dòng)物中的SnRK被命名為AMPK (AMP-activated protein kinase)，得名于該蛋白受細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比例的升高而激活[16]。植物中的SnRK分為3個(gè)亞族[17]，SnRK2、SnRK3/CIPK為植物特有，而SnRK1則與酵母SNF1和哺乳動(dòng)物AMPK高度同源[18]。SnRK1通常在細(xì)胞能量不足的情況下被激活，并抑制諸多生物合成反應(yīng)以及植物生長(zhǎng)[19-23]。SnRK1被認(rèn)為參與生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫應(yīng)答以及疾病防御在內(nèi)的多種生物學(xué)進(jìn)程。例如，擬南芥SnRK1可磷酸化轉(zhuǎn)錄因子bZIP63，改變后者的二聚化狀態(tài)，從而通過(guò)影響bZIP63對(duì)下游基因的表達(dá)調(diào)控而應(yīng)答饑餓脅迫[24]。Kim等報(bào)道了一種SnRK1家族的蛋白AKIN10，可以通過(guò)磷酸化乙烯受體EIN3而延遲乙烯促進(jìn)的植物器官衰老[25]。另有報(bào)道，AKIN10還可以通過(guò)磷酸化作用下調(diào)AtMYC2介導(dǎo)的鹽脅迫耐受能力[26]。小麥SnRK1還可以與TaFROG相互作用，介導(dǎo)植物對(duì)真菌病原禾谷鐮刀菌的抗性[27]。鑒于目前對(duì)TCTP和SnRK1的研究進(jìn)展，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)TCTP在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中功能研究的初步結(jié)果，本研究借助酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和Co-IP進(jìn)一步驗(yàn)證二者間的相互作用，明確二者發(fā)生相互作用的細(xì)胞部位，對(duì)進(jìn)一步研究TCTP和SnRK1在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的功能，豐富和完善小麥抗葉銹病機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

小麥抗葉銹近等基因系Tc與本生煙草為本課題組長(zhǎng)期保存。

小麥種植后，生長(zhǎng)至第一片葉完全展開(kāi)后，接種小麥葉銹菌生理小種260，小麥的種植條件和葉銹菌的接種采用Qiao等[28]的方法。本生煙草在溫室中生長(zhǎng)21 d左右，至4–5片葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，具體種植條件參照Sparkes等的方法[29]。

1.2 實(shí)驗(yàn)中所用引物

本實(shí)驗(yàn)所涉及的引物及其名稱和用途見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.3 基因克隆

將葉銹菌生理小種260接種于小麥葉片表面，48 h后取接種葉片并在液氮中速凍，打碎材料后提取總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用引物TCTP F/R擴(kuò)增編碼區(qū)全長(zhǎng) (長(zhǎng)度為507 bp)，利用引物SnRK1 F/R擴(kuò)增的編碼區(qū)全長(zhǎng) (長(zhǎng)度為1 503 bp)，并分別連接至克隆載體pEASY-T1上，藍(lán)白斑篩選后，測(cè)序由北京華大基因股份有限公司完成。

1.4 酵母雙雜交載體構(gòu)建

為了獲得用于構(gòu)建酵母雙雜交載體的和開(kāi)放閱讀框序列，分別采用引物Y2H TCTP F/R和Y2H SnRK1 F/R進(jìn)行擴(kuò)增。因其酶切位點(diǎn)與基因之間無(wú)保護(hù)堿基，這兩個(gè)基因分別與其在最終載體中上游的Active domain和Binding domain處于相同的開(kāi)放閱讀框。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并切膠回收，采用RⅠ和HⅠ進(jìn)行雙酶切后，與同樣經(jīng)雙酶切的載體pGADT7-AD和pGBKT7連接，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株。對(duì)得到的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，測(cè)序由北京華大基因股份有限公司完成。在測(cè)序時(shí)，pGADT7-AD-和pGADT7-AD-使用通用引物T7和3AD，pGBKT7-和pGBKT7-采用通用引物T7和3BD，所得測(cè)序結(jié)果可用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 酵母雙雜交

使用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母AH109。實(shí)驗(yàn)組為pGBKT7-和pGADT7-AD-共轉(zhuǎn)化、pGBKT7-和pGADT7-AD-共轉(zhuǎn)化，以pGADT7和pGBKT7空載體共轉(zhuǎn)化作對(duì)照。為了檢測(cè)兩個(gè)基因的自激活活性，以pGBKT7-和pGBKT7-載體分別與pGADT7-AD空載體共轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的酵母分別涂在SD/-Leu/-Trp (SD/-LW, 二缺)平板培養(yǎng)基上，放置28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?4 d。然后挑取單菌落至SD/-LW液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，直至600≈0.5，取5 μL菌液并分別滴在SD/-LW、SD/-Leu/-Trp/-His (SD/-LWH, 三缺)和SD/-LWHA平板培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，相機(jī)拍照后記錄結(jié)果。

使用ONPG法[30]對(duì)酵母的基因活性進(jìn)行檢測(cè)。將滅菌后的濾紙?jiān)陂L(zhǎng)出菌落的SD/-LW培養(yǎng)基上影印，將濾紙經(jīng)液氮反復(fù)凍融10次，置于干凈的培養(yǎng)皿中。在濾紙上滴加含有20 mg/L X-Gal的Z-Buffer (16.1 g/L Na2HPO4·7H2O、5.5 g/L Na2HPO4·H2O、0.75 g/L KCl、0.246 g/L MgSO4·7H2O)，避光、30 ℃靜置5 h，拍照記錄。

1.6 雙分子熒光互補(bǔ)載體的構(gòu)建

為了獲得用于構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體的和開(kāi)放閱讀框序列，使用引物BiFC TCTP F/R和BiFC SnRK1 F/R分別進(jìn)行擴(kuò)增，酶切位點(diǎn)與基因之間無(wú)保護(hù)堿基，使這兩個(gè)基因分別與其在最終載體中上游的和處于相同的開(kāi)放閱讀框。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后回收，經(jīng)HⅠ和Ⅰ雙酶切后，與同樣經(jīng)雙酶切的載體pSPYNE和pSPYCE進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株。使用片段擴(kuò)增用引物分別對(duì)連pSPYNE-和pSPYCE-單克隆進(jìn)行PCR鑒定，測(cè)序由北京華大基因股份有限公司完成，使用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì) 分析。

1.7 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

采用瞬時(shí)表達(dá)法，將攜帶有相互作用蛋白基因的質(zhì)粒在煙草葉片中表達(dá)[29]。對(duì)分別攜帶有pSPYNE-、pSPYCE-、pSPYNE-和pSPYCE-質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，600值約為0.8時(shí)，5 000×離心3 min后富集菌體，所得菌體用無(wú)菌水洗滌，再用煙草侵染緩沖液 (9.76 g/L MES、0.76 g/L Na3PO4·12H2O、5 g/L 葡萄糖、0.1 mmol/L AS) 重懸菌體。將攜帶有pSPYNE和pSPYCE的農(nóng)桿菌按照表2的組合混合，例如：第1組為pSPYNE和pSPYCE-混合，第5組為pSPYNE-和pSPYCE-混合，兩種菌液的混合比例為1∶1，并在煙草葉片下表皮注射。48 h后取煙草葉片，使用激光掃描共聚焦顯微鏡 (FV1000，奧林巴斯) 在488 nm觀察并 照相。

1.8 Co-IP植物表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究涉及的免疫共沉淀 (Co-IP) 實(shí)驗(yàn)所需載體均以pCAMBIA3301為背景骨架進(jìn)行構(gòu)建。pCAMBIA3301帶有受CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因，在GUS基因的上下游分別有Ⅰ和E Ⅱ酶切位點(diǎn)。以引物BV-TCTP F/R擴(kuò)增CDS區(qū)全長(zhǎng)，并經(jīng)過(guò)Ⅰ和E Ⅱ酶切后連接至pCAMBIA3301載體上。使用引物BV-SnRK1 F/R對(duì)去掉終止密碼子的CDS區(qū)全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，以Ⅰ酶切，并連接至載體pCAMBIA3301-。對(duì)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以硫酸卡那霉素篩選，經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證后，可以分別得到受CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因植物表達(dá)載體和受CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的融合表達(dá)載體。

表2 BiFC實(shí)驗(yàn)所用的農(nóng)桿菌組合攜帶的基因

1.9 Co-IP實(shí)驗(yàn)

免疫共沉淀是驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)所用的Co-IP方法參考Mair等的研究[24]。將攜帶和(或) 表達(dá)載體的農(nóng)桿菌組合注射煙草下表皮，48 h后取材并液氮研磨。使用冰上預(yù)冷的RIPA緩沖液提取總蛋白，并在蛋白中加入Anti-Flag Mouse monoclonal antibody (稀釋度1∶500) 捕獲標(biāo)簽蛋白。在捕獲后的蛋白提取液中加入Protein A/G agarose，并離心收集。在Protein A/G agarose中加入2×蛋白上樣緩沖液并煮沸，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，一抗為Anti-GFP Mouse monoclonal antibody (稀釋度1∶2 000)，使用ECL發(fā)光檢測(cè)抗體分布并以X光片成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母雙雜交載體的構(gòu)建

酵母雙雜交載體以pGADT7-AD和pGBKT7為載體骨架，使用酶切-連接法構(gòu)建。使用引物Y2H-TCTP F/R擴(kuò)增編碼區(qū)全長(zhǎng)，使用引物Y2H-SnRK1 F/R擴(kuò)增編碼區(qū)全長(zhǎng)。分別和克隆載體連接，后將酶切正確的克隆產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。鑒定正確的克隆產(chǎn)物和表達(dá)載體pGADT7-AD和pGBKT7分別經(jīng)RⅠ和HⅠ雙酶切，將基因片段和載體片段回收，并分別進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌。酶切驗(yàn)證結(jié)果表明在約為507 bp和1 503 bp處檢測(cè)到DNA片段 (圖1)，片段長(zhǎng)度與和的預(yù)期序列長(zhǎng)度相同，表示載體構(gòu)建成功。

2.2 雙分子熒光互補(bǔ)載體的構(gòu)建

雙分子熒光互補(bǔ)載體以pSPYNE和pSPYCE為載體骨架，使用酶切-連接法構(gòu)建，與酵母雙雜交載體構(gòu)建的過(guò)程類似。使用引物BiFC-TCTP F/R擴(kuò)增TaTCTP編碼區(qū)全長(zhǎng)，使用引物BiFC-SnRK1 F/R擴(kuò)增TaSnRK1編碼區(qū)全長(zhǎng)。連接克隆載體后測(cè)序鑒定。將鑒定正確的克隆與表達(dá)載體pSPYNE和pSPYCE分別經(jīng)HⅠ和Ⅰ雙酶切，并分別連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌。酶切鑒定結(jié)果顯示，與酶切前比較分別在約為507 bp和1 503 bp處檢測(cè)到DNA片段 (圖2)，與和的預(yù)期序列長(zhǎng)度一致，表示載體構(gòu)建成功。

圖1 酵母雙雜交載體的驗(yàn)證

2.3 免疫共沉淀植物表達(dá)載體的構(gòu)建

Co-IP實(shí)驗(yàn)選擇的植物表達(dá)載體骨架為pCAMBIA3301，該載體為典型的植物雙元表達(dá)載體，可在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(Phosphinothricin acetyltransferase, PAT)和GUS。本實(shí)驗(yàn)以Ⅰ和E Ⅱ?qū)US基因切下，并連接所需的片段，從而使目的片段受原基因上游的CaMV 35S啟動(dòng)子調(diào)控。此外，對(duì)于連接有基因的pCAMBIA3301-載體，使用Ⅰ將載體線性化，并連接基因的開(kāi)放閱讀框，開(kāi)放閱讀框下游的終止密碼子“TGA”被去掉，以實(shí)現(xiàn)和下游基因的融合表達(dá)。上述兩個(gè)載體在連接后，分別使用NcoⅠ/EⅡ和Ⅰ酶切鑒定。酶切后的pCAMBIA3301-和pCAMBIA3301--均可以檢測(cè)出和預(yù)期分子量大小的條帶 (圖3)，表示載體構(gòu)建成功。

圖2 雙分子熒光互補(bǔ)載體的驗(yàn)證

2.4 TCTP與SnRK1相互作用的酵母雙雜交檢測(cè)

本研究的酵母雙雜交使用GAL4轉(zhuǎn)錄因子拆分系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有4個(gè)報(bào)告基因，分別以、、和對(duì)應(yīng)組氨酸缺陷互補(bǔ)、腺嘌呤缺陷互補(bǔ)、α-半乳糖苷酶和金擔(dān)子素A抗性[31]，本研究檢測(cè)了前3個(gè)報(bào)告基因的活性。結(jié)果顯示 (圖4)，共同轉(zhuǎn)化攜帶和開(kāi)放閱讀框質(zhì)粒的酵母可以在SD/-LWH和SD/-LWHA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明和報(bào)告基因被激活。將攜帶和開(kāi)放閱讀框的pGBKT7質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化酵母，發(fā)現(xiàn)酵母不能在SD/-LWH和SD/-LWHA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明和基因不具有自激活活性。

圖3 Co-IP植物表達(dá)載體的驗(yàn)證

將凍融破碎細(xì)胞的酵母經(jīng)X-α-Gal顯色，結(jié)果顯示共同轉(zhuǎn)化攜帶和開(kāi)放閱讀框質(zhì)粒的酵母印記為藍(lán)色，說(shuō)明報(bào)告基因被激活。以上結(jié)果說(shuō)明TCTP與SnRK1在酵母中發(fā)生了相互作用。

2.5 TCTP與SnRK1相互作用的雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

將攜帶和開(kāi)放閱讀框序列的pSPYNE和pSPYCE載體單獨(dú)或共同注射煙草葉片的下表皮細(xì)胞，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下對(duì)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)行觀察并成像。結(jié)果顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)化或的煙草均不能觀察到熒光，而兩個(gè)基因共同轉(zhuǎn)化的煙草可以觀察到很強(qiáng)的熒光信號(hào)，并且二者發(fā)生相互作用產(chǎn)生的熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞質(zhì)中 (圖5)。這一結(jié)果表明，TaTCTP和TaSnRK1可以在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用，并且二者的相互作用主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。

2.6 TCTP與SnRK1相互作用的Co-IP檢測(cè)

為了檢測(cè)TCTP和SnRK1在植物細(xì)胞內(nèi)的互作情況，本研究以TCTP為誘餌蛋白釣取該蛋白的相互作用蛋白，并使用Western雜交檢測(cè)釣取的蛋白中是否含有SnRK1。為了避免煙草中本底表達(dá)的TCTP或SnRK1同源蛋白對(duì)本實(shí)驗(yàn)造成干擾，提高檢測(cè)的特異性，將二者均與蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)，分別產(chǎn)生Flag-TCTP和SnRK1-GFP融合蛋白。上述兩個(gè)融合蛋白為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)組，將Flag-TCTP和GFP混合注射的蛋白樣品作為對(duì)照組，以排除TCTP和GFP標(biāo)簽發(fā)生相互作用的可能性。在Input樣品中，可以檢測(cè)出Flag-TCTP和SnRK1、GFP的條帶，表示3種蛋白都存在于待檢測(cè)樣品中 (圖6)。在IP樣品中，使用Flag抗體釣取的蛋白中可以用GFP抗體檢測(cè)到SnRK1-GFP融合蛋白的條帶，表示TCTP可以與SnRK1在植物細(xì)胞內(nèi)相互作用。在對(duì)照組中未檢出GFP條帶 (圖6)，表示Flag-TCTP和SnRK1-GFP的相互作用是特異性的，并非由前者和GFP蛋白標(biāo)簽結(jié)合引起。

圖4 酵母雙雜交檢測(cè)TaTCTP和TaSnRK1的相互作用

圖5 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TaTCTP和TaSnRK1在煙草葉片表皮細(xì)胞中的相互作用

圖6 TaTCTP和TaSnRK1相互作用的Co-IP檢測(cè)

3 討論

高等植物進(jìn)化出了多條免疫途徑來(lái)抵御病原物的侵染，其中病原菌侵染誘發(fā)的超敏性反應(yīng)——細(xì)胞程序性死亡 (HR-PCD) 是植物抵御活體寄生真菌病原的主要途徑之一[32]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，HR-PCD是小麥抵御葉銹菌侵染的重要防衛(wèi)反應(yīng)[33]。目前已知有多種信號(hào)分子參與調(diào)控小麥-葉銹菌互作中HR-PCD的發(fā)生和擴(kuò)展，包括Ca2+、NO和H2O2，且Ca2+信號(hào)位于H2O2和NO的上游，對(duì)HR-PCD進(jìn)程起了決定性的調(diào)控作用[28]。然而，該信號(hào)分子通過(guò)何種途徑調(diào)控HR-PCD，目前尚無(wú)定論。本課題組前期借助EGTA螯合胞外Ca2+，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以期發(fā)掘HR-PCD發(fā)生過(guò)程中Ca2+下游的調(diào)控基因[34]，發(fā)現(xiàn)TCTP在Ca2+的下游發(fā)揮作用。并且，在小麥近等基因系Tc與葉銹菌生理小種366組成的不親和組合中，在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)葉銹菌侵染[13]。

為了闡明TCTP在葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的HR-PCD過(guò)程中的分子機(jī)制，本課題組前期借助TAP-MS技術(shù)對(duì)小麥接種葉銹菌后TCTP的互作蛋白進(jìn)行了鑒定，并對(duì)TCTP與索馬甜類蛋白 (Thaumatin-like protein, TLP) 間的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證[35]，為進(jìn)一步深入研究TLP作為一類重要的病程相關(guān)蛋白成員，在小麥抵御葉銹菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控方式，TCTP也已被認(rèn)為可參與HR-PCD發(fā)生的調(diào)控過(guò)程[36]。與TCTP互作的蛋白激酶很可能是葉銹菌誘發(fā)小麥發(fā)生HR-PCD的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。目前對(duì)SnRK1的研究表明，它是一個(gè)蛋白激酶復(fù)合物，其中a亞基是它的催化亞基，β和g亞基是調(diào)節(jié)亞基[37]，SnRK1參與植物生長(zhǎng)和發(fā)育等諸多生物學(xué)過(guò)程，尤其對(duì)淀粉的降解和合成具有重要調(diào)節(jié)作用[38]。另外SnRK1也參與調(diào)控植物抵抗病原菌侵染的作用，如SnRK1可以作為孤兒蛋白TaFROG的互作因子，共同響應(yīng)小麥抵御禾谷鐮孢菌的侵染過(guò)程[27]。水稻SnRK1過(guò)表達(dá)植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育受阻，增強(qiáng)了水楊酸和茉莉酸途徑介導(dǎo)的防御反應(yīng)，并增加了對(duì)半活體營(yíng)養(yǎng)型和死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抵抗力，而該基因的沉默則增加了對(duì)這些病原物的敏感性[39]。馬鈴薯病毒Y的HC-Pro組分可以和StubSNF1 (一種SnRK1家族成員)的調(diào)節(jié)亞基StubGAL83相互作用，并下調(diào)后者的表達(dá)，從而瓦解植株抗性，積累更多的病毒RNA[40]。因此本研究對(duì)TCTP與SnRK1互作關(guān)系的鑒定可以促進(jìn)對(duì)小麥-葉銹菌互作過(guò)程中TCTP調(diào)控HR-PCD擴(kuò)展分子機(jī)制的深入研究。此外，經(jīng)過(guò)與Perochon等[27]研究中SnRK1序列進(jìn)行比對(duì)分析，本研究涉及的SnRK1為其構(gòu)成同源蛋白復(fù)合體的a亞基。

本研究使用了3種檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的方法，即酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀。TaTCTP定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，而TaSnRK1定位在細(xì)胞質(zhì)中，并且兩者均不含有跨膜結(jié)構(gòu)，因此適用于GAL4轉(zhuǎn)錄因子酵母雙雜交系統(tǒng)[41]。本研究在經(jīng)過(guò)酵母雙雜交驗(yàn)證二者間存在物理互作后 (圖4)，又通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證了二者的互作關(guān)系，且證明二者的互作發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中 (圖5)。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)也有若干體系，其中常用的有黃色熒光蛋白拆分系統(tǒng) (Spilt YFP system) 和熒光素酶拆分系統(tǒng) (Spilt luciferase system)[42]。熒光素酶拆分系統(tǒng)適用于檢測(cè)蛋白質(zhì)間發(fā)生弱互作的檢測(cè)，并且可以從活體水平上進(jìn)行[43]。黃色熒光蛋白拆分系統(tǒng)則可以從亞細(xì)胞水平進(jìn)行觀察，分析蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的位置[44]。這對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的復(fù)合物功能研究具有重要意義。本研究使用黃色熒光蛋白拆分系統(tǒng)的BiFC，發(fā)現(xiàn)TCTP和SnRK1的相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，這與我們之前對(duì)TCTP和TLP相互作用研究的結(jié)果相似。雖然TCTP具有在細(xì)胞核中的定位，但TCTP和SnRK1的相互作用并不發(fā)生在細(xì)胞核中，暗示二者形成的復(fù)合物可能參與葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的HR-PCD過(guò)程中胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)的傳遞過(guò)程。

在Co-IP實(shí)驗(yàn)中Rubisco大亞基通?？梢苑翘禺愋缘嘏c抗體結(jié)合，在約51 kDa的位置產(chǎn)生干擾信號(hào)，用于IP的抗體也會(huì)混合在樣品中，并被二抗檢測(cè)到，抗體的重鏈 (Heavy chain, HC) 會(huì)在約55 kDa的位置產(chǎn)生干擾信號(hào)。上述兩種來(lái)源的干擾會(huì)對(duì)SnRK1的檢出造成干擾，后者的預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為57 kDa。因此，本研究在Co-IP實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)中，將SnRK1與GFP融合表達(dá)，融合蛋白的預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量約為84 kDa (圖6)，在避免其他蛋白對(duì)結(jié)果干擾的同時(shí)，利用GFP標(biāo)簽抗體本身的高特異性可以很好地保證檢測(cè)的靈敏度。盡管本實(shí)驗(yàn)明確了TCTP與SnRK1的互作關(guān)系，但二者在葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的HR-PCD過(guò)程中的具體功能仍不清楚，還需要利用遺傳學(xué)手段對(duì)二者在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上下游關(guān)系進(jìn)行研究，明確二者發(fā)生相互作用的具體生理功能，進(jìn)而完善小麥響應(yīng)葉銹菌侵染誘發(fā)的HR-PCD發(fā)生的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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Interaction between wheat translationally controlled tumor protein TCTP and SNF1-related protein kinase SnRK1

Nan Ma, Jinzhu Qiao, Wenqian Tang, Tianjie Sun, Na Liu, Yan Chen, Xingtong Lu, Shengfang Han, and Dongmei Wang

Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology, College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China

Translationally controlled tumor proteins (TCTP) and SNF1- related protein kinase (SnRK1) are conserved and widely present in eukaryotic cells. TCTP regulates cell division, plant growth and development, and mediates plant resistance against pathogen infection. SnRK1 participates in a range of physiological processes including sugar metabolism and resistance to abiotic and biotic stresses. Previous work in our laboratory demonstrated that wheat TCTP can respond toinfection and induce host defense responses. In order to further investigate the mechanism of TaTCTP in wheat resistance toinfection, we used TAP (tandem affinity purification) and mass spectrometry to screen the potential interactants of TaTCTP. A SNF1- related protein kinase (SnRK1) was identified as a potential interacting protein of TaTCTP. The results of yeast two-hybrid assay showed that TCTP could interact with SnRK1 in yeast, and the yeast carrying TCTP and SnRK1 could grow on SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (SD/-LWHA) medium. The fluorescence signal of the interaction between TCTP and SnRK1 was found to be distributed in the cytoplasm in the Bi-fluorescense complementation experiment. Co-IP experiments further showed that TCTP and SnRK1 could interact in plant cells. This study lays an important foundation for further studying the mechanism of TaTCTP in the interaction between wheat and, and it play a great influence on further improving the molecular mechanism of wheat resistant to.

translationally controlled tumor proteins, SNF1- related protein kinase, yeast two hybrid, BiFC, Co-IP

January 31, 2019;

June 10, 2019

Hebei Innovation Funding Program for Doctoral Candidates (No. CXZZBS2019103), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31171472, 31871548).

s: Shengfang Han. Tel: +86-312-7528276; E-mail: hansf123@163.com

Dongmei Wang. Tel: +86-312-7528276; E-mail: dongmeiwang63@126.com

河北省博士研究生創(chuàng)新項(xiàng)目 (No. CXZZBS2019103)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31171472, 31871548) 資助。

2019-06-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190628.1330.001.html

麻楠, 喬金柱, 湯文倩, 等. 小麥翻譯控制腫瘤蛋白TCTP與蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK1的相互作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(9): 1686–1697.

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(本文責(zé)編 陳宏宇)