李德軍，郎丹丹，翁蔚琪

(1.臺州市腫瘤醫(yī)院，浙江 溫嶺 317500；2.珠海市人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling，SOCS3)與腫瘤細胞的持續(xù)增殖和機體的抗腫瘤免疫能力密切相關(guān)。SOCS3表達的下調(diào)使信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(singal transducer and activator of transcription 3，STAT3)持續(xù)磷酸化不僅促進白血病細胞增殖和抗凋亡基因產(chǎn)生，而且干擾機體抗腫瘤免疫，影響微小病變殘留的清除并增加復發(fā)的風險[1-2]。近年來，人們開始嘗試通過干擾腫瘤生長和存活中所依賴的信號通路來治療癌癥，相對于化療而言，這種新方法能夠很好地區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞，因而能更特異地殺死腫瘤細胞，而不損傷正常細胞。本研究測定了SOCS3在兒童急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中的表達情況、SOCS3表達異常對STAT3表達水平的影響、SOCS3表達水平高低與兒童ALL疾病狀態(tài)及危險度之間的關(guān)系，同時測定了ALL患兒STAT3 mRNA表達水平及CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細胞水平，探討SOCS3在兒童ALL疾病狀態(tài)和危險度評估、腫瘤免疫及靶向治療中的應用情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

Ficoll分離液，天津生物科技有限公司；小牛血清，揚州四季青有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津生物科技有限公司；TRIzol Reagent，美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Themero Scientific公司；SYBR-GREEN試劑盒，美國Themero Scientific公司；抗人SOCS3抗體，蘇州生物技術(shù)有限公司；藻膽色素蛋白(phycoerythrin，PE)標記的鼠抗人IgG抗體，美國eBioscience公司；異硫氰酸熒光素酯(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的抗人CD4，美國eBioscience公司；別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標記的抗人CD25抗體及同型對照抗體，美國eBioscience公司；PE標記的抗人FOXP3試劑及同型對照抗體，美國eBioscience公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2研究對象

選擇2016年1月至2017年1月就診于臺州市腫瘤醫(yī)院兒科血液病區(qū)的新診斷ALL患兒45例為研究對象(ALL組)。入組對象為年齡在1個月至18歲的ALL患兒，對ALL診斷符合法美英合作組(French-American-British cooperative group，F(xiàn)AB)診斷標準；排除成熟B-ALL、混合表型白血病、第二腫瘤、免疫缺陷病、非初治。所有入組患兒按照中國兒童腫瘤協(xié)作組(Chinese Children’s Cancer Collaboration Group，CCCG)-ALL-2015方案化療，一般分為誘導緩解、鞏固治療、繼續(xù)治療階段。同時選擇13名健康兒童為正常對照組，因?qū)φ战M健康兒童標本資料獲取困難，研究選擇了停藥的ALL患兒作為正常對照組。按照兒童ALL患者治療結(jié)束后復發(fā)率約為6%，如緩解能夠持續(xù)4年，此時復發(fā)幾率<1%，可被定義為“治愈”，因此研究選擇停藥至少5年的13例ALL患兒為正常對照組。所有患兒家長在入組時均簽署化療同意書、廢棄標本可用于科研同意書。兩組兒童基線資料比較見表1。

項目ALL組(n=45)對照組(n=13)t/χ2P男/女23(51.1)/22(48.9)7(53.8)/6(46.2)0.560.432年齡(歲)5.8±1.65.5±1.30.230.759 ≤1038(84.4)10(76.9) >107(15.6)3(23.1)白細胞(×109/L)22.0±12.36.5±2.352.630.001 ≤5029(64.4) >5016(35.6)血紅蛋白(g/L)70.6±25.3108.7±12.316.520.001血小板(×109/L)42.3±25.4156.7±36.836.520.001乳酸脫氫酶(IU/L)534.5±153.7265.2±121.542.620.001骨髓原始細胞(%)82.6±32.3白血病細胞起源 B-ALL42(93.3) T-ALL3(6.7)危險度分組 低危組16(35.6) 中危組20(44.4) 高危組9(20.0)融合基因 TEL/AML6(13.3) BCR/ABL4(8.9) POX1(2.2) MLL1(2.2)

1.2方法

1.2.1骨髓單個核細胞的提取

使用乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管分別采集ALL組45例患兒初診時、完全誘導緩解期，以及13例正常對照組兒童新鮮骨髓液4mL，用等體積0.01mol/L的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋、混勻；取10mL無菌的離心管，加入比重為1.077/mL的淋巴細胞分離液約4mL，將稀釋后的骨髓在離液面約1cm處緩慢滴加，使其形成一明顯分界面，上下液面切勿混合；水平離心機以1 800g/min離心15min后，小心取出無菌離心管，可見離心管中細胞從上而下分為四層，第一層為血漿層、第二層為乳白色淋巴細胞層、第三層為透明分離液層、第四層為紅細胞層；小心吸取位于第二層的乳白色淋巴細胞層至新的無菌離心管內(nèi)，用移液槍吸取20μL用于計數(shù)，余用7～10倍體積0.01mol/L的PBS液稀釋，以1 500g/min離心10min后，留取底層細胞，用0.01mol/L的PBS液洗滌2～3次；去上清液，取約2×107個細胞用于流式細胞分析，余加入凍存液，分裝3管至1.5mL無菌凍存管內(nèi)，各管細胞數(shù)為2×107個，放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應

取出凍存的RNA樣本，常溫下溶解后，取少量RNA溶液用二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水稀釋(1:100)后，微量光度計測定所有RNA樣本A260/A280為1.8～2.0；將逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo K1622)于-20℃冰箱保存，融化后，將試劑盒中各組分混勻并稍微離心，離心后置于冰上。設(shè)置無逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照(NTC)，NTC可用于評估基因組DNA對RNA樣品的污染狀況。設(shè)置陽性對照，陽性對照試劑盒中已經(jīng)提供陽性對照所需的RNA模板和基因特異性引物。人磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)對照RNA(1.3kb)是通過體外轉(zhuǎn)錄方式得到的，GAPDH特異性引物與人、小鼠、大鼠的GAPDH基因完全互補，RT-PCR后的產(chǎn)物長度大約496bp。引物由Invitrogen公司合成，具體步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.2.3流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg細胞

選擇合適流式管，做好標記，各管中分別加入100μL細胞懸液；分別加入CD4、CD25抗體及同型對照，CD25同型對照管加CD4抗體和CD25同型對照抗體；CD4 CD25管加CD4抗體和CD25抗體，F(xiàn)oxp3同型對照管加CD4抗體和CD25抗體，CD4 CD25 Foxp3加CD4抗體和CD25抗體，混勻，4℃避光孵育30min；設(shè)置無抗體的陰性對照，不含有骨髓單個核細胞，但含有實驗所需的其他組分。

1.3統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1 ALL組與對照組STAT3 mRNA和SOCS3 mRNA的表達情況

ALL組的STAT3 mRNA表達水平顯著高于對照組，SOCS3 mRNA表達水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；經(jīng)誘導緩解治療后，骨髓細胞學和微小殘留白血病(minimal residual disease，MRD)結(jié)果證實，45例患兒均獲得完全誘導緩解，與初診時相比較，SOCS3 mRNA表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)；緩解期患兒SOCS3 mRNA表達水平恢復正常，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

組別初診STAT3mRNASOCS3mRNA誘導緩解期SOCS3mRNAtP對照組0.87±0.144.25±0.374.25±0.3739.430.001ALL組3.11±1.170.62±0.043.71±0.28t12.8165.911.68P0.0010.0010.06

2.2 不同危險度ALL患兒細胞SOCS3 mRNA的表達情況

將45名患兒按照初診時危險度分為低、中、高危三組，比較三組間患兒骨髓單個核細胞SOCS3 mRNA水平，低危組均低于中危組、高危組，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，中危組與高危組比較SOCS3 mRNA的表達水平相似(P>0.05)，見表3。

組別SOCS3 mRNA低危組0.60±0.14中危組1.53±0.19高危組1.51±0.18t1(P1)26.35(0.001)t2(P2)30.52(0.001)t3(P3)0.51(0.84)

注：1低危組vs.中危組，2低危組vs.高危組，3中危組vs.高危組。

2.3初診時SOCS3 mRNA高表達組與低表達組的臨床特點

初診時SOCS3 mRNA高表達組有更高的白細胞計數(shù)和乳酸脫氫酶水平，與低表達組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，初診時SOCS3 mRNA高表達組和低表達組經(jīng)化療后，誘導緩解率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

2.4 ALL患兒初診時Treg細胞水平檢測情況

ALL組患兒初診CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+CD127lowTreg)水平增高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低危、中危、高危三組ALL患兒CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表4 初診時SOCS3 mRNA高表達組與低表達組臨床特點比較結(jié)果

注：易位性白血病/急性髓系白血病(translocation ETS leukemia/acute myeloid leukemia，TEL/AML)；B細胞抗原受體(B cell antigen receptor，BCR)；非受體酪氨酸激酶(abelson gene，ABL)；脯氨酸氧化酶(proline oxidase，POX)。

組別例數(shù)(n)CD4+CD25+CD127lowTreg(個/mL)對照組135.22±0.49ALL組458.05±1.33t12.64P0.001低危組168.96±2.20中危組207.98±1.26高危組98.40±2.11F1.63P0.72

3討論

3.1 ALL的Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導子和激活子信號通路機制

隨著白血病分子診斷學技術(shù)的不斷升級和對信號轉(zhuǎn)導通路的深入研究，拓展了對于白血病發(fā)病機制的了解。幾乎在所有的頭頸部腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了STAT3異常的活化，在白血病細胞中也普遍存在著Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導子和激活子(janus kinase/signal transducer and activator，JAK-STAT)信號通路的持續(xù)激活。因此，STAT3蛋白也就成為重要的檢測指標之一，在各類成人和兒童白血病中檢查STAT也持續(xù)處于激活狀態(tài)[3-4]。通過抑制STAT3的持續(xù)磷酸化可以抑制白血病細胞的增殖，促使其凋亡。然而到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)STAT3基因水平上的突變，故STAT3的持續(xù)活化一般都是信號分子的調(diào)節(jié)失控或者負調(diào)控分子的突變亦或缺失造成其功能的失調(diào)，其中SOCS3負性反饋調(diào)節(jié)的異常是STAT3持續(xù)表達的主要機制。

SOCS3是細胞因子信號通路轉(zhuǎn)導抑制因子家族的重要成員，是負性調(diào)控JAK/STAT信號通路最重要的分子，通過調(diào)控SOCS3的表達可以達到抑制JAK/STAT信號通路上包括JAK、STAT在內(nèi)的一系列細胞因子的活化水平。有研究發(fā)現(xiàn)，在實體瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌中均可以檢測到SOCS3表達的沉默/低表達，在血液系統(tǒng)腫瘤中同樣發(fā)現(xiàn)了SOCS3的沉默/低表達，SOCS3的沉默/低表達導致STAT3通路的持續(xù)磷酸化和抗腫瘤凋亡的表達被認為是白血病的可能發(fā)病機制；在慢性淋巴細胞白血病(CLL)和急性髓性白血病(AML)中均發(fā)現(xiàn)SOCS3的低表達，導致STAT3的持續(xù)磷酸化和抗腫瘤凋亡基因高表達，最終導致白血病的發(fā)生[5-7]。本研究測定了45例新發(fā)ALL患兒初治時STAT3 mRNA表達水平，結(jié)果顯示，ALL組患兒的STAT3 mRNA表達水平明顯高于正常對照組，與其他同類研究結(jié)果相似，證實STAT3參與了兒童ALL的發(fā)生，兒童ALL發(fā)病過程中存在STAT3的高表達。

3.2 SOCS3與JAK/STAT信號通路的關(guān)系

在白血病中SOCS3的表達受到抑制，致使JAK/STAT信號通路的持續(xù)活化導致抗凋亡基因的激活和腫瘤細胞的增殖。本研究中發(fā)現(xiàn)中危、高危組ALL患兒初診時的SOCS3表達水平均顯著高于低危組，這似乎與其作用機制相矛盾，分析原因可能和SOCS3可以與SOCS家族的其他分子相互作用有關(guān)，一方面SOCS3在細胞因子白介素(IL)-6等誘導下表達上調(diào)，負反饋調(diào)控STAT3通路；另一方面SOCS3的高表達也會抑制SOCS1、SOCS2等負性調(diào)節(jié)分子的表達水平，進而引起IL-2、IL-3等細胞因子的過度表達，最終使STAT3過度活化。SOCS3與細胞因子之間的關(guān)系還有待于更加深入的研究。SOCS作為細胞因子信號轉(zhuǎn)導負調(diào)控因子，與血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，SOCS表達水平與白血病的疾病狀態(tài)及預后的關(guān)系也引起了關(guān)注。有對AML的研究中發(fā)現(xiàn)，SOCS2的表達水平高低影響著兒童AML的臨床特點、誘導緩解率及長期無病生存率[8-9]。SOCS3作為SOCS家族的重要成員，參與了白血病的發(fā)生及調(diào)控，其表達水平的高低與ALL臨床特點及預后的關(guān)系目前尚未見研究報道。本研究采用熒光定量PCR的方法測定了45例新發(fā)ALL患兒初診時SOCS3表達水平，結(jié)果顯示，ALL患兒的SOCS3表達水平顯著低于正常組水平，而在誘導緩解期SOCS3水平較初診時表達上調(diào)并恢復至正常水平；免疫熒光組織化學染色聯(lián)合激光共聚焦顯微技術(shù)實驗的結(jié)果也驗證了SOCS3在ALL患兒不同治療時期的表達量不同，其證實SOCS3同樣參與了兒童ALL的發(fā)生、發(fā)展，在兒童ALL中由于各種原因?qū)е耂OCS3的表達水平下調(diào)，使ALL患兒JAK/STAT3信號通路持續(xù)磷酸化和抗凋亡基因高表達，最終促進腫瘤細胞的增殖。

3.3 ALL患兒SOCS3表達與疾病臨床特征的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，SOCS3表達水平的差異與ALL的外周血細胞計數(shù)水平、乳酸脫氫酶水平、融合基因及疾病危險度相關(guān)。SOCS3高表達組有更高的外周血白細胞計數(shù)及乳酸脫氫酶水平，且預后不良基因病例更多，可能最終導致了SOCS3高表達組具有更多的中危、高危病例；而SOCS3低表達組具有更多的預后良好基因病例，致使低表達組的低危病例數(shù)更高。此外，SOCS3低表達組和TEL/AML融合基因密切相關(guān)，SOCS3低表達組的ALL患兒中TEL/AML陽性者占23.8%。在TEL-JAK2融合基因陽性的T淋巴母細胞淋巴瘤(T-cell lymphoblasticlymphoma，T-LBL)患者中存在SOCS3基因的甲基化和表達下調(diào)，通過去甲基化等手段上調(diào)SOCS3表達可以提高TEL-JAK2基因陽性的T-LBL治療效果。通過調(diào)節(jié)SOCS3水平或許可以為TEL/AML陽性ALL患兒的治療提供新思路。此外，通過干擾腫瘤生長和存活所依賴的信號通路可以起到治療癌癥的效果，相對于化療而言，這種新方法能夠很好地區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞，因而能更特異地殺死腫瘤細胞，而不損傷正常細胞。有研究報道在實體腫瘤中通過基因轉(zhuǎn)入或者去甲基化的手段提高SOCS3表達水平可以抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[10-11]。在慢性淋巴細胞白血病中通過提高SOCS3的表達同樣可以抑制白血病細胞的增殖[12-13]。

3.4 ALL患兒CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平表達的分析

CD4+CD25+CD127lowTreg細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫抑制性調(diào)節(jié)細胞，其通過多種機制抑制免疫效應細胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素。研究指出，關(guān)于CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的臨床及基礎(chǔ)研究提示，ALL細胞惡性克隆與CD4+CD25+CD127lowTreg細胞高表達導致的免疫抑制相關(guān)，白血病體內(nèi)的微小病變殘留主要依靠機體的自身免疫功能來清除[14]。ALL患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平表達顯著高于正常人，而在疾病治愈后CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平恢復正常。也有研究報道CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平表達與急性白血病危險度有關(guān)，在相同治療階段，ALL患兒中危、高危組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平顯著高于低危組[15]。CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平與兒童ALL之間的密切關(guān)系使得針對CD4+CD25+CD127lowTreg細胞進行腫瘤免疫治療成為治療白血病的新策略，通過控制體內(nèi)CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的數(shù)量和功能有利于提高患者的抗腫瘤免疫能力及對微小病變殘留的清除。

本研究中發(fā)現(xiàn)ALL患兒初診時CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平顯著高于對照組兒童，而中危、高危組患兒與低危組患兒CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平無明顯差別，其證實了在兒童ALL中存在CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平的異常表達，而通過各種手段調(diào)控CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的數(shù)量和功能或許可以增強機體對白血病細胞的清除。本研究觀察到在兒童ALL中，由于SOCS3的低表達致使STAT3持續(xù)活化，同時CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平升高，因此猜測在ALL中STAT3的持續(xù)活化可以導致CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的表達增高，進而影響機體抗腫瘤免疫，所以通過調(diào)節(jié)STAT3表達水平來調(diào)節(jié)CD4+CD25+CD127lowTreg細胞水平為腫瘤免疫和微小病變殘留的清除提供了新的思路，然而具體作用機制還有待于進一步研究。

綜上所述，SOCS3與兒童ALL發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，SOCS3的低表達可以導致ALL中STAT3的持續(xù)活化，監(jiān)測SOCS3水平可以了解疾病狀態(tài)，評價危險度，SOCS3的低表達與TEL/AML融合基因的密切關(guān)系為調(diào)控SOCS3來治療融合基因陽性的白血病提供了新的思路。SOCS3或許可以成為治療兒童ALL的藥物靶點，通過調(diào)控SOCS3的表達水平可能為兒童白血病的治療開辟新的前景，最終實現(xiàn)提高兒童ALL誘導緩解率和治愈率，減少ALL的復發(fā)的目標。