陳晨 李巖 卓勤 霍軍生 萬麗葵

摘 要：目的：研究樺褐孔菌誘導肺癌細胞周期阻滯和凋亡的作用，為樺褐孔菌在抗腫瘤方面的應用提供科學依據(jù)。方法：將不同濃度的樺褐孔菌與人肺癌A549細胞共同培養(yǎng)后，采用CCK-8法檢測細胞存活率，使用流式細胞技術(shù)檢測細胞周期分布和細胞凋亡率的變化。結(jié)果：樺褐孔菌能夠抑制A549細胞的生長，并誘導其凋亡。濃度為2、4mg/mL的樺褐孔菌液作用于A549細胞48h后，與對照組相比，細胞存活率分別顯著下降至83.32%和69.27%（P<0.05，對照組為92.11%），早期凋亡率分別顯著增至6.47%和8.07%（P<0.01，對照組為1.98%），總凋亡率顯著增至14.27%和27.54%（P<0.05，對照組為5.91%），晚期凋亡率增至7.8%（P>0.05）和19.48%（P<0.01，對照組為3.94%）。細胞周期檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，4mg/mL樺褐孔菌與A549細胞孵育24h后，G2/M期細胞顯著增加至22.12%（P<0.01，對照組為12.5%）;孵育48h后，G0/G1期顯著增加至68.87%（P<0.01，對照組為59.87%）。結(jié)論：樺褐孔菌能夠誘導A549細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G0/G1期以及G2/M期。

關(guān)鍵詞： 樺褐孔菌;A549細胞;凋亡;細胞周期

樺褐孔菌是藥用真菌，俗稱白樺茸。國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗氧化、降血壓等多種生物活性[1-7]，但是具體的作用機制并不清楚。本研究以人肺癌A549細胞為研究對象，探索樺褐孔菌對人肺癌A549細胞的細胞周期與凋亡的影響，為進一步探討作用機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 細胞 樺褐孔菌樣品來源地為俄羅斯，粉末狀。

1.1.2 試劑 A549人非小細胞肺癌細胞，中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫;F-12K培養(yǎng)液，Invitrogen公司;胎牛血清，Gibco公司;AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒，BD公司;碘化丙啶，PI，Biolegend公司;CCK-8試劑盒，日本同仁公司;0.25%胰酶，Gibco公司;青鏈霉素，Gibco公司。

1.1.3 儀器 倒置顯微鏡，Nikon公司;酶標儀，Molecular Devices公司;流式細胞儀，BD公司;低溫冷凍離心機，貝克曼公司;CO2培養(yǎng)箱，Heal Force公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、100U/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的F-12K完全培養(yǎng)液，于37℃恒溫、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d消化傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 樺褐孔菌溶液的配制 用100℃熱水配制濃度為100mg/mL樺褐孔菌溶液，放置2h冷卻后，用F-12K完全培養(yǎng)液稀釋成濃度為80、40、20、10、5mg/mL的溶液。

1.2.3 A549細胞生長曲線繪制 取對數(shù)生長期的人肺癌A549細胞，用F-12K完全培養(yǎng)液將細胞調(diào)整為1×105/mL、5×104/mL、2.5×104/mL、1×104/mL濃度的細胞懸液。將細胞懸液加入96孔板中，每孔100μL，同時設置空白對照組（100μL F-12K完全培養(yǎng)液），于12、24、48、72h使用CCK-8試劑盒檢測細胞活性。

1.2.4 CCK-8法檢測樺褐孔菌對人肺癌A549細胞生長的影響 取對數(shù)生長期的人肺癌A549細胞，用F-12K完全培養(yǎng)液將細胞調(diào)整為5×104/mL細胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入90μL，然后置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h，待A549細胞貼壁生長后，分別加入不同濃度樺褐孔菌溶液10μL，使受試物最終濃度為10、8、4、2、1、0.5mg/mL，同時設置陰性對照組（加入10μL F-12K完全培養(yǎng)液）和空白對照組（90μL F-12K完全培養(yǎng)液+10uL F-12K完全培養(yǎng)基），每組設6個平行孔，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，酶標儀490nm測定各孔光密度值（OD）。按式（1）計算細胞抑制率，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

細胞抑制率（%）=（陰性對照組OD值-實驗組OD值）/（陰性對照組OD值-空白組OD值）×100%（1）

1.2.5 流式細胞儀分析細胞周期及凋亡 用F-12K完全培養(yǎng)液將細胞調(diào)整為5×104/mL細胞懸液，取2mL接種于6孔板，實驗分為4、2、1mg/mL劑量組和陰性對照組4個組，孵育過夜。樺褐孔菌用完全培養(yǎng)基稀釋成40、20、10mg/mL，吸去上層培養(yǎng)基，每孔加入1.8mL完全培養(yǎng)基，另加0.2mL相應劑量的樺褐孔菌溶液，陰性對照組加入0.2mL F-12K完全培養(yǎng)基。

（1）細胞周期檢測：樺褐孔菌處理細胞24h和48h后，收集細胞，調(diào)整為106/mL，PBS洗2次，250r/min離心5min，盡可能去除上清，-20℃預冷的70%乙醇1mL固定細胞，逐滴加入，邊加邊振蕩，確保充分的固定又防止細胞成團，4℃固定30min以上。用PBS洗2次，2 000/min離心5min，小心地棄上清，防止細胞損失。加入50μL 100μg/mL的RNase，37℃孵育30min，加入200μL 50μg/mL碘化丙啶（PI），充分振蕩，孵育15min后，使用流式細胞儀檢測分析細胞周期。實驗重復3次。（2）細胞凋亡檢測：樺褐孔菌處理細胞48h后，收集上清液和底層全部細胞。加入5μL FITC Annexin V和5μL PI，輕微振蕩，室溫下孵育15min，加入400μL Binding Buffer，使用流式細胞儀檢測活細胞、壞死細胞、早期凋亡、晚期凋亡細胞百分比，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差的形式表示，使用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。3組以上數(shù)據(jù)的比較，若方差齊，則進行方差分析，有顯著性差異時，使用Dunnet t檢驗進行各劑量組與對照組的比較;若方差不齊，使用秩和檢驗進行多組比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞生長曲線

如圖1所示，5×104/mL濃度細胞接種于96孔板后孵育48h即達到對數(shù)生長期，可用于下一步實驗。

2.2 樺褐孔菌對細胞生長狀況的影響

如圖2～3所示，樺褐孔菌孵育A549細胞48h，隨著樺褐孔菌濃度增加，450nm OD值下降，細胞抑制率升高，IC50為4.73mg/mL。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

如表2所示，2mg/mL和4mg/mL樺褐孔菌孵育A549細胞48h后，A549細胞的活細胞率顯著下降（P<0.05），早期凋亡率和總凋亡率顯著升高（P<0.01、P<0.05）。4mg/mL劑量組晚期凋亡和壞死細胞率顯著升高（P<0.01）。如圖4所示，隨著樺褐孔菌濃度升高，晚期凋亡和壞死細胞率亦升高。

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期分布

如表3所示，樺褐孔菌孵育A549細胞處理24h后4mg/mL劑量組A549細胞G2/M期細胞顯著升高（P<0.01），12mg/mL劑量組A549細胞G0/G1期細胞顯著升高（P<0.05、P<0.01），1、2、4mg/mL劑量組S期細胞顯著降低（P<0.05、P<0.01、P<0.01）。如表4所示，處理48h后各劑量組A549細胞G0/G1期細胞顯著升高（P<0.01），S期細胞顯著降低（P<0.05），4mg/mL劑量組G2/M期細胞顯著升高（P<0.05）。

3 討論

研究表明，樺褐孔菌對乳腺癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞有抑制作用，其抗腫瘤機制主要可能是通過影響腫瘤細胞周期、抑制其增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等途徑發(fā)揮作用[8-11]。目前肺癌缺乏有效的治療手段，在中藥中找到能夠抑制腫瘤的高效低毒性的藥物成為研究的熱點之一。CCK-8法是一種操作簡便、靈敏度高、步驟少、結(jié)果準確可靠、重復性好的細胞活性檢測方法，對實驗者和環(huán)境危害低[12-13]。本研究使用人肺癌A549細胞，運用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活性，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期，評價樺褐孔菌誘導人肺癌A549細胞凋亡和周期阻滯的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌可降低A549細胞活力，進而由流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌可以誘導A549細胞凋亡。肺腺癌主要與腫瘤細胞周期紊亂進而引起細胞過度生長、增殖有關(guān)。細胞周期依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白（Cyclin）調(diào)節(jié)細胞周期的進展，在細胞有絲分裂周期不同時段起重要作用，可引起細胞周期失衡，導致細胞生長、分化障礙，后導致細胞的惡性增殖，腫瘤隨之發(fā)生[14]。Youn等[15]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌提取物使肝癌HepG2細胞阻滯于G0 /G1期，并通過抑制CDK6、CDK4、CDK2、CyclinE、CyclinD1、CyclinD2抑制腫瘤細胞生長。王文娟[16]等研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌提取物能夠顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖，樺褐孔菌提取物使腫瘤細胞阻滯在G2期，使細胞增殖受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，4mg/mL樺褐孔菌與A549細胞孵育24h后，G2/M期細胞顯著增加至22.12%（P<0.01，對照組為12.5%）;孵育48h后，G0/G1期顯著增加至68.87%（P<0.01，對照組為59.87%），使細胞周期阻滯于G2/M和G0/G1期。

本研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌對人肺癌細胞有誘導凋亡和周期阻滯作用，使A549細胞產(chǎn)生G2/M期和G0/G1期阻滯，為樺褐孔菌成為抗肺癌的物質(zhì)提供了科學依據(jù)，為下一步作用機制研究打下實驗基礎。

參考文獻

[1]王李俊，楊琴，王飛，等.樺褐孔菌醇誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的分子機制研究[J].中草藥，2016，47（6）：970-973.

[2]劉婷婷，邢青斌，程家麗，等.樺褐孔菌氨基酸含量測定方法的建立[J].營養(yǎng)學報，2017，39（5）：504-506.

[3]吳昆，程文明，李春如，等.樺褐孔菌抗腫瘤活性部位的篩選及化學成分研究[J].安徽醫(yī)科大學學報，2016，51（10）：1468-1472.

[4]Staniszewska Justyna，Szymański Marcin，Ignatowicz Ewa.Antitumor and immunomodulatory activity of Inonotus obliquus[J].Herba Polonica，2017，63（2）：48-58.

[5]Konrad A.Szychowski，Kamila Rybczyńska-Tkaczyk，Jakub Tobiasz，et al.Biological and anticancer properties of Inonotus obliquus extracts[J].Process Biochemistry，2018（73）：180-187.

[6]Satoru Arataa，b，Jun Watanabea，et al.Continuous intake of the Chaga mushroom （Inonotus obliquus）aqueous extract suppresses cancer progression and maintains body temperature in mice[J].Heliyon，2016，2（5）：e00111.

[7]Lee，Seulki，Cho，Hyosun.Anti-tumor effect of Inonotus obliquus in xenograft animals with EBV+human gastric carcinoma[J].The Korean Journal of Microbiology，2016，52（4）：482-486.

[8]馬偉平，侯睿，陳正愛.樺褐孔菌抗腫瘤作用的研究進展[J].醫(yī)學研究生學報，2017，30（4）：440-443.

[9]于婧璐，馮曉玲.樺褐孔菌抗腫瘤機制的研究進展[J].實用腫瘤學雜志，2017，31（1）：69-72.

[10]Chung MJ，Chung CK，Jeong Y，et al.Anticancer activity of subfractions containing pure compounds of Chaga mushroom （Inonotus obliquus）extract in human cancer cells and in Balb/c mice bearing Sarcoma-180 cells[J].Nutr Res Pract，2010，4（3）：177-182.

[11]Zhong XH，Ken K，Lvs J，et al.Progress of research on inonotus obliquus[J].Chin J Integr Med，2009，15（2）：156-160.

[12]Tominaga H，Ishiyamam，Ohsetof，et al.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay[J].Analytical Communications，1999（36）：47-50.

[13]熊建文，肖化，張鎮(zhèn)西.MTT法和CCK-8法檢測細胞活性之測試條件比較[J].激光生物學報，2007，16（5）：559-562.

[14]黎美琳，顧鵬.基質(zhì)交聯(lián)分子1表達下調(diào)對人胰腺癌SW1990細胞周期及細胞凋亡的影響[J].中華細胞與干細胞雜志（電子版），2017（5）：265-270.

[15]Youn MJ，Kim JK，Park SY，et al.Chaga mushroom（Inonotus obliquus）induces G0 /G1 arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells[J].World J Gastroenterol，2008，14（4）：511-517.

[16]王文娟，雒向?qū)?，晁旭，?樺褐孔菌提取物對人肝癌HePG2細胞增殖及凋亡的影響[J].陜西醫(yī)學雜志，2013，42（7）：783-785.

Abstract：Objective To study apoptosis and cycle arrest of lung cancer cells induced by Inonotus obliquus，and provide new evidence for anti-tumor therapy of Inonotus obliquus.MethodHuman lung cancer cell line A549 was incubated with different concentrations of Inonotus obliquus.Cell viability was measured by CCK-8 method.Apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.Result Inonotus obliquus inhibitted the growth and induced apoptosis of A549 cells.The results of the Inonotus obliquus groups on the concentrations of 2 mg/mL and 4 mg/mL were compared with control group.Viable cell percentages were significantly decreased to 83.32% and 69.27%，respectively （P<0.05，92.11% in the control group），the early apoptotic rate significantly increased to 6.47% and 8.07% （P<0.01，1.98% in control group），the total apoptotic rate significantly increased to 14.27% and 27.54% （P<0.05，5.91% in control group），the late apoptosis rate significantly increased to 7.8% （P>0.05）and 19.48% （P<0.01，3.94% in control group）.Compared with the control group，the cells in G2/M phase increased significantly to 22.12% after incubating A549 cells with 4mg/mL Inonotus obliquus for 24h （P<0.01，12.5% ?in control group），the cells in G0/G1 phase increased significantly to 68.87% after incubating A549 cells for 48h （P<0.01，59.87% in control group）.Conclusion Inonotus obliquus can induce the apoptosis of A549 cells，and arrest cells in G0/G1 phase and G2/M phase.

Keywords：Inonotus obliquus;A549 cells;apoptosis;cell cycle

（責任編輯 唐建敏）