肖穩(wěn) 張海韻 楊滔 賀燕 嚴禮 高晗

摘 要：基于傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法檢測周期長、效率不高等缺陷，本研究通過合成一種羧甲基殼聚糖-分子信標-金納米材料，采用一種新的基于分子信標共價功能化的殼聚糖技術(shù)和金納米團聚比色的方法對含SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌進行檢測。在羧甲基殼聚糖上交聯(lián)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的適配體，當加入靶標之后，由于靶標與環(huán)狀結(jié)構(gòu)適配體結(jié)合導致分子信標剛性結(jié)構(gòu)崩解，插入莖狀結(jié)構(gòu)中的金納米顆粒（GNRs）釋放出來，當在溶液中加入一定量的NaCl溶液后，金納米顆粒會發(fā)生團聚，根據(jù)聚合度的不同，產(chǎn)生相應顏色變化，從而實現(xiàn)對含SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測，結(jié)果表明：通過檢測金納米顆粒發(fā)生的顯色反應的吸光度可以實現(xiàn)對含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌進行快速檢測，并且這種方法具有較高的特異性和靈敏度。在此檢測體系中，靶標濃度和顯色反應的吸光度值在0.05～0.5μmol/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，并且對于靶標DNA的檢測下限為50nmol/L。

關(guān)鍵詞：生物傳感器;鼠傷寒沙門氏菌;分子信標

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是一種具有較為嚴重威脅的腸道致病菌[1-2]，而鼠傷寒沙門氏菌毒力島基因所表達產(chǎn)生的毒力蛋白和毒素能夠?qū)е逻@些癥狀的發(fā)生[3-4]。SSeC基因是位于鼠傷寒沙門氏菌毒力島-2上的基因，它所表達的毒素蛋白能夠引起宿主發(fā)生一系列多器官的功能障礙。因此，SSeC基因可以作為檢測鼠傷寒沙門氏菌的重要的標記物[5]。傳統(tǒng)的沙門氏菌培養(yǎng)和檢測技術(shù)又稱國標法，該種方法是建立在以從樣品中分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)的常規(guī)方法上。一般來說，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)結(jié)果是準確、可靠的，但需經(jīng)過預增菌以及生化試驗、血清學試驗等一系列復雜繁瑣的操作，檢測周期一般需要5～7d才能完成，因此檢測效率較低[6]。本實驗旨在研究一種能夠?qū)κ髠抽T氏菌進行快速檢驗且具有良好的靈敏度和特異性的方法，通過合成了一種羧甲基殼聚糖-分子信標-金納米材料作為生物傳感器，采用一種新的基于分子信標共價功能化的殼聚糖技術(shù)和金納米團聚比色的方法對含SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌進行檢測。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

羧甲基殼聚糖，Ballancom Life Sciences Dep;濃鹽酸，株洲市星空化玻有限責任公司;濃硝酸，株洲市石英化玻有限責任公司;氯金酸，南京化學試劑股份有限公司;檸檬酸三鈉，無錫市民豐試劑廠;1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC），Aladdin;N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），Aladdin;無水乙醇，天津市福晨化學試劑廠;氯化鈉（NaCl），國藥集團化學試劑有限公司;氯化鉀，湖南試劑廠;12水磷酸氫二鈉，天津市化學試劑六廠;磷酸二氫鉀，天津市福晨化學試劑廠;磷酸二氫鈉，天津市化學試劑六廠;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物，杭州微生物試劑有限公司;適配體，生工生物工程（上海）股份有限公司。

核酸序列：分子信標：NH2-GCGCTCGGCCTCCTCTGCCATCTCATTCGCGAGCC;靶標DNA：CGAATGAGATGGCAGAGGAGGC;1個錯配序列：CGAATGAGATGGCAGAGGAGTC;4個錯配序列：CGGACGAGATGGAAGAGGAGTC;5個錯配序列：CGGGCGAGATGGAAGAGGAGTC。

1.2 儀器

磁力加熱攪拌器（HSC-19），Joanlab群安實驗儀器有限公司;型定時電動攪拌器（JJ-1），江蘇正基儀器有限公司;高速微量離心機（D3024），Dragonlab大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司;往復式水浴恒溫振蕩器（SHA-C），常州澳華儀器有限公司;雙光束紫外可見分光光度計（T9CS），北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米金的制備 向量筒中加入300mL濃鹽酸，再加入100mL濃硝酸，待1h左右不冒氣泡，顏色變?yōu)榫萍t色即為可使用的王水。配制1%的氯金酸溶液，38.8mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，4℃避光保存。吸取1%氯金酸1.65mL于錐形瓶中，加入38.35mL水，將錐形瓶置于磁力加熱攪拌器上進行避光回流（錐形瓶上接冷凝管），錐形瓶中放入攪拌子，同時磁力攪拌，待溶液沸騰，立即加入6.4mL 38.8mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)避光回流，加熱攪拌，保持沸騰15min。移除熱源，攪拌至冷卻，得到酒紅色的分散狀態(tài)的納米金溶液。用0.22μm針頭式水溶性過濾器過濾納米金溶液后，避光4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 羧甲基殼聚糖-適配體-納米金材料制備條件的優(yōu)化 配制濃度為30mg/mL的羧甲基殼聚糖溶液。向溶液中加入NHS 0.17g，攪拌15min，然后在2℃冰水浴攪拌器中，以800r/min攪拌下，緩慢滴入EDC的水溶液（0.26g EDC在15mL離心管中，加入5mL去離子水溶解）。10min滴加完成后，仍在冰水浴下繼續(xù)攪拌反應1h，使羧甲基殼聚糖的羧基充分活化。為了探索羧甲基殼聚糖和分子信標的最佳質(zhì)量比，我們設(shè)計了10個質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10加入分子信標（適配體）至上述溶液中，處理1h。得到羧甲基殼聚糖-分子信標復合物。每一個不同的質(zhì)量比進行3次重復實驗。取1mL自制納米金溶液于 EP管中，4℃、10 000r/min離心10min，棄上清，重懸。向上述納米金溶液中加入配好的羧甲基殼聚糖-適配體復合物100μL，混勻，置于37℃搖床中孵育30h。為除去可能過量的適配體，將上述混合液在4℃、10 000r/min離心10min，棄上清，最終得到羧甲基殼聚糖-適配體-納米金材料，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 靶標DNA檢測 取EP管，加入配好的羧甲基殼聚糖-分子信標-金納米復合物100μL，加入靶標DNA，使靶標DNA終濃度為0、50、100、200、300、400、500nmol/L，于37℃孵育30min。加入1.5mol/L的NaCl溶液使釋放出的GNRs團聚，觀察溶液，若有顏色變化（紅變藍），則實驗可行。用紫外可見分光光度計檢測最大吸收波長（520nm左右）的吸光度A值，每個濃度進行3次重復實驗，取3次重復實驗A值的平均值繪制標準曲線，進行定量測定。

1.3.4 錯配實驗 取5個EP管，分別為空白對照組、目標組、1個錯配、4個錯配、5個錯配組。每管加入配好的羧甲基殼聚糖-分子信標-金納米復合物100μL，將相同濃度的目標DNA序列和3種不同錯配的DNA序列分別加入相同的反應體系中進行檢測。每個組進行3次重復實驗，取平均吸光度值進行比較，如果目標組吸光度值最高，空白和錯配均低于目標組較多，空白和錯配組差別不大，則證明該方法有選擇性和特異性。

1.3.5 樣品檢測 將鼠傷寒沙門氏菌在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中36℃培養(yǎng)24h，經(jīng)平板計數(shù)后，將不同濃度的菌體（105～108CFU/mL）95℃水浴15min，置冰上10min以獲取相應的ssDNA作為實驗組，空白樣品作為空白對照組，在實驗組和對照組中分別加入100μL配好的羧甲基殼聚糖-分子信標-金納米復合物，于37℃搖床孵育1h，對照組不加菌液，其余條件相同。分別加入1.50mol/L的NaCl溶液，混勻，觀察溶液顏色變化，用紫外分光光度計檢測最大吸收波長（520nm左右）的吸光度A值，進行定量測定。另外，取金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、單核細胞增生李斯特菌（5×107CFU/mL）的DNA在相同的條件下進行樣品檢測以證明該方法對于鼠傷寒沙門氏菌的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基殼聚糖-適配體-納米金材料制備條件的優(yōu)化

如果在反應體系中存在有處于游離狀態(tài)的分子探針，就會有可能造成出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果，因此，進行分子信標和羧甲基殼聚糖的最佳比例分析是非常有必要的[7-8]。本研究將羧甲基殼聚糖的濃度設(shè)為30mg/mL，探討上述10種不同的分子信標/羧甲基殼聚糖的比例，分別制備形成羧甲基殼聚糖-適配體-納米金材料后加入1.50mol/L的NaCl溶液，混勻，觀察溶液顏色變化，用紫外分光光度計檢測最大吸收波長（520nm左右）的吸光度A值。當兩者的比例小于1∶4時，吸光度值基本上變化不大，但是當比例大于1∶4時吸光度值驟然上升。這表明當分子信標/羧甲基殼聚糖的比例小于1∶4時，分子信標完全結(jié)合到羧甲基殼聚糖上，體系中不存在游離的分子信標。當分子信標/羧甲基殼聚糖的比例大于1∶4時，羧甲基殼聚糖的表面已經(jīng)完全被分子信標所覆蓋，體系中存在剩余游離的分子信標，故導致吸光度A值迅速上升。1∶4的比例表明形成的羧甲基殼聚糖-適配體-納米金材料造成強大空間位阻以阻止分子信標進一步結(jié)合，因此，1∶4是兩者的最佳比例（圖1）。

2.2 靶標DNA檢測

如圖2所示，隨著靶標DNA濃度的增加，溶液的吸光度值也不斷增加，在靶標DNA濃度為0.05～0.5μmol/L內(nèi)與吸光度值呈線性關(guān)系，表明該方法在一定范圍內(nèi)可以對靶標DNA進行定量檢測，按照3S/K計算出該方法對靶標DNA的檢測下限可達50nmol/L。

2.3 錯配實驗

如圖3所示，在加入了靶標DNA之后體系的吸光度值顯著增加，這是由于靶標DNA使分子信標發(fā)生解崩，插入莖狀結(jié)構(gòu)中的金納米顆粒（GNRs）釋放出來。而在加入了錯配的堿基序列時，吸光度值遠遠低于靶標，即使只有1個堿基的差別，靶標吸光度值還是錯配堿基序列的近3倍。這說明該檢測方法對于鼠傷寒沙門氏菌具有很好的選擇性和特異性，它應該能夠很好地分辨出不同于鼠傷寒沙門氏菌的其他血清型沙門氏菌，并且反應迅速。

2.4 樣品檢測

以空白對照組樣品的吸光度值進行調(diào)零，檢測各組不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌，105～108CFU/mL隨著濃度的不斷上升，各組的吸光度值也不斷增大（圖4）。

此外，取不同類別的濃度為107CFU/mL的細菌在相同的條件下進行檢測，如圖5所示，加入鼠傷寒沙門氏菌的吸光度值遠遠大于其他3種細菌，表明只有含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌才能使靶標DNA分子信標解崩釋放出金納米粒子，從而產(chǎn)生顯色反應，從而說明該檢測方法對于鼠傷寒沙門氏菌具有較強的特異性。

3 結(jié)論

本研究設(shè)計了一種新穎的、快速的基于分子信標共價功能化的殼聚糖技術(shù)和金納米團聚比色的生物傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌，該傳感器用于檢測含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌其檢測下限可以達到50nmol/L，并且在DNA濃度為0.05～0.5μmol/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測下限低于一些文獻報道的結(jié)果[9-10]，并且該種檢測方法具有較好的選擇性和特異性。該檢測方法用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測相比于傳統(tǒng)沙門氏菌檢測方法具有更高的檢測效率，但是本研究也存在一定的局限性，如未能實現(xiàn)對于鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，檢測的對象也僅只限于鼠傷寒沙門氏菌這一種血清型。實現(xiàn)對于沙門氏菌的快速、定量檢測有待進一步深入探討和研究。

參考文獻

[1]Mulder D T，Mcphee J B，Reidyu S A，et al.Multiple histidines in the periplasmic domain of the Salmonella enterica sensor kinase SsrA enhance signaling in response to extracellular acidification[J].Molecular Microbiology，2015，95（4）：678-691.

[2]Aydin M，Carter-Conger J，Gao N，et al.Molecular identification of common Salmonella serovars using multiplex DNA sensor-based suspension array[J].Analytical & Bioanalytical Chemistry，2018，410（10）：1-10.

[3]馮飛，謝振文，曾慕衡.鼠傷寒沙門氏菌多重PCR檢測方法的研究[J].中國生物工程雜志，2011，31（1）：65-69.

[4]王凱，殷涌光.SPR生物傳感器快速檢測沙門氏菌研究初探[J].食品科技，2007，32（9）：192-195.

[5]胡靜，胡佳佳，R.Guntupalli，等.磁致伸縮生物傳感器尺寸對沙門氏菌檢測靈敏度的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2015，31（6）：277-281.

[6]胡靜，胡佳佳，沈雯，等.同時檢測沙門氏菌和炭疽桿菌磁致伸縮生物傳感器制備與應用[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2016，32（5）：297-301.

[7]寧毅.高特異性碳納米生物傳感器快速檢測沙門氏菌的研究[D].長沙：湖南師范大學，2014.

[8]申靜，孟雪，那美玲，等.基于NMR納米探針的生物傳感器用于快速檢測沙門氏菌[J].食品工業(yè)科技，2016，37（5）：187-190.

[9]邱婷婷.基于限制性核酸內(nèi)切酶放大技術(shù)的沙門氏菌檢測生物傳感器[D].濟南：濟南大學，2016.

[10]劉柯驛.基于適配體信號放大技術(shù)的沙門氏菌快速檢測方法的研究[D].長沙：湖南師范大學，2016.

Abatract：Based on the defects of traditional Salmonella detection methods such as long-term，low-efficiency，a novel carboxymethyl chitosan-molecular beacon-gold nanomaterial was synthesized.Salmonella typhimurium containing SSeC gene was detected by a novel chitosan technique based on covalent functionalization of molecular beacons and gold nano-agglomeration colorimetric method.The aptamer of the cyclic structure was cross-linked on carboxymethyl chitosan.After the target was added，the molecular beacon rigid structure disintegrates due to the binding of the target to the cyclic aptamer，and the gold nanoparticle inserted into the stem structure is inserted.The particles （GNRs）were released.When a certain amount of NaCl solution was added to the solution，the gold nanoparticles would agglomerate，and corresponding color changes would be produced according to the degree of polymerization，thereby realizing rapid detection of Salmonella typhimurium containing SSeC gene.The experimental results showed that the rapid detection of Salmonella typhimurium containing SSeC gene would be achieved by detecting the absorbance of the color reaction of gold nanoparticles，and this method had high specificity and sensitivity.In this detection system，the target concentration and the absorbance value of the color reaction had a good linear relationship in the range of 0.05 μmol/L to 0.5 μmol/L，and the detection limit for the target DNA was 50 nmol/L.

Keywords：biological sensor; Salmonella typhimurium;molecular beacon

（責任編輯 唐建敏）