張瑤++蒙麗君++官菊芳++晉曉勇

摘要：通過抗原抗體的特異性識別作用以及生物條形碼的信號放大作用，構(gòu)建了一種新的電化學免疫傳感器，用以檢測人免疫球蛋白（hIgG）。將抗體Ab1修飾到金電極上，加入抗原（hIgG），經(jīng)過抗原抗體的免疫反應再將已制備好的納米金標記抗體Ab2和生物條形碼（Ab2-AuNPs-B）修飾到該免疫傳感器上，通過觀察電化學阻抗的變化來監(jiān)控免疫傳感器的構(gòu)建過程。利用生物條形碼的信號放大作用，通過循環(huán)伏安法和差示脈沖伏安法對hIgG的含量進行定量檢測，其檢出限達到0.4×10-5 mg/L。

關鍵詞：生物條形碼；信號放大技術；生物傳感器；hIgG；納米金

中圖分類號： Q511文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0308-04

收稿日期：2015-02-26

基金項目：國家自然科學基金（編號：21067010、21365016）。

作者簡介：張瑤（1989—），女，碩士研究生，主要從事生化分析及生物傳感器的研究。E-mail：zdjcyylx@163.com。

通信作者：晉曉勇，博士，副教授，主要從事生化分析及生物傳感器的研究。Email：xiaoyongjin @126.com。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎，它對人體的健康有著極其重要的作用[1-4]。人免疫球蛋白G（hIgG）是血清中含量最高的一種免疫蛋白，是機體再次免疫應答后形成抗體的主要組分，在機體防御機制中發(fā)揮著重要的作用，在臨床上作為多種疾病診斷及療效評價的重要指標[5-7]，因此對其進行定性、定量檢測顯得尤為重要。傳統(tǒng)的免疫分析法檢測hIgG由于存在操作步驟較為繁瑣、儀器設備昂貴等缺點，因此在實際應用中受到了一定的限制，難以較大范圍推廣。

傳統(tǒng)檢測hIgG的方法主要有質(zhì)譜法[8]、熒光分析法[9-10]、電化學分析法[11-13]等。其中，電化學方法由于具有較高的靈敏度、極低的檢測限逐漸受到廣泛關注。生物條形碼因其較高的選擇性和生物特異性也日益受到人們廣泛重視[14-15]。早期的生物條形碼主要用于DNA的檢測[16-17]，而在蛋白質(zhì)分子的檢測及應用方面還鮮有報道。綜合以上背景，本研究將電化學方法與生物條形碼相結(jié)合，以hIgG為模型蛋白，對其進行定量定性分析。

1材料與方法

1.1儀器和材料

電化學工作站（EC550，湖北武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司），UV-265紫外儀（日本島津），三電極體系：金盤電極（直徑2.0 mm），飽和甘汞電極（SCE），Pt電極，KQ-2200B超聲清洗器（江蘇昆山超聲儀器廠）。

本試驗所用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）均為：Na2HPO4（天津市化學試劑六廠）和NaH2PO4（山東萊陽市雙雙化工有限公司）的混合溶液，Na2CO3（陜西西安化學試劑廠），氯金酸、疊氮化鈉（阿拉丁試劑公司）等均為分析純，試驗用水均為超純水。

兔抗人IgG抗體（Ab1）、hIgG、羊抗人IgG抗體（Ab2）購于北京博奧森生物技術有限公司。條形碼序列B：5′-SH-TAGTAAGTAA-FC-3′ 合成于上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2納米金（AuNPs）的制備

將100 mL 的氯金酸（0.01%）加入到250 mL的圓底燒瓶中加熱，攪拌至沸騰后向其中加入4.0 mL的檸檬酸三鈉（1%），繼續(xù)加熱10 min [18]，制成的納米金于4 ℃下保存，用于制備金標抗體。

1.3AuNPs與Ab2及條形碼序列（B）的結(jié)合（Ab2-AuNPs-B）

試驗原理如圖1-a所示，具體試驗步驟如下：用Na2CO3調(diào)節(jié)納米金pH值至9.0，加入100 μL Ab2（250 mg/L）振蕩混勻，室溫靜置3 h，除去上清液中游離抗體，將離心后聚合物分散于0.05 mol/L含有0.05%疊氮化鈉的PBS（pH值7.0）中。后將100 μL B（10 μmol/L）加入已制備好的Ab2-AuNPs中振蕩均勻，室溫靜置1 h。離心，除去上清液中未結(jié)合的B。將已制備好的Ab2-AuNPs-B分離到0.05 mol/L含有 0.05% 疊氮化鈉的PBS（pH值7.0）中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4電極修飾及免疫傳感器的構(gòu)建

將金電極（直徑2.0 mm）用0.3 μm的Al2O3粉末打磨洗凈，再用0.05 μm的Al2O3粉末將金電極打磨至光滑鏡面。超純水分2次超聲清洗5 min，并將金電極浸入新制的Piranha溶液[98% H2SO4 ∶H2O2（體積比）=7 ∶3]約15 min。依次用超純水、95%乙醇超聲約3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中，在0～1.5 V電位范圍內(nèi)掃循環(huán)伏安曲線直至峰形穩(wěn)定。最后依次用超純水、95%乙醇、丙酮超聲3 min，氮氣吹干表面，作為工作電極備用。滴加10 μL Ab1修飾于金電極表面，一定時間后，用PBS（pH值7.0）緩沖液沖洗數(shù)次，再滴加BSA（1%）溶液封閉電極30 min，用PBS（pH值7.0）沖洗。

1.5目標物的分析檢測

滴加10 μL hIgG，使之與電極上修飾的Ab1特異性結(jié)合，一定時間后，用PBS（0.01 mol/L，pH值7.0）緩沖液沖洗數(shù)次，除去未結(jié)合的hIgG，再滴加10 μL Ab2-AuNPs-B。采用三電極體系，以玻碳電極為工作電極，Pt電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用循環(huán)伏安法和差示脈沖伏安法對hIgG進行檢測。

2結(jié)果與分析

2.1試驗原理

基于生物條形碼及納米金信號放大的電化學免疫傳感器檢測hIgG的構(gòu)建過程如圖1所示。首先將Ab1固定于金電極表面，加入hIgG及Ab2-AuNPs-B，經(jīng)過抗原抗體的免疫反應，構(gòu)建免疫傳感器。通過納米金及生物條形碼將檢測信號放大。最后通過電化學差示脈沖伏安法對條形碼上標記的二茂鐵進行檢測，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定量檢測。

2.2表征B-AuNPs-Ab2

B-AuNPs-Ab2形成以后，AuNPs所處化學環(huán)境發(fā)生改變。結(jié)合基團的紫外吸收光譜中的波長及吸光度會發(fā)生變化。因此，本研究采用紫外-可見光譜法來監(jiān)控 B-AuNPs-Ab2的形成。

B-AuNPs-Ab2的合成方法如“2.3”節(jié)所述，通過紫外可見吸收光譜對其組成及化學性質(zhì)進行表征。如圖2所示，AuNPs和B-AuNPs-Ab2的最大吸收波長分別在525 nm和533 nm處。B-AuNPs-Ab2的吸收峰相比AuNPs吸收峰發(fā)生紅移，主要原因可能是AuNPs上結(jié)合了Ab2及B使顆粒尺寸變大，顆粒周圍的微環(huán)境發(fā)生改變。在270 nm處，B-AuNPs-Ab2相對于AuNPs有較強的的吸收峰。說明，Ab2與B已經(jīng)成功修飾在納米金上（圖2）。

2.2電極表面不同狀態(tài)的阻抗表征

法拉第阻抗圖譜是一種測量電極界面性質(zhì)的有效方法，能用于表征免疫傳感器的組裝過程，阻抗圖譜包括高頻的半圓部分（相當于動力學控制的過程）和低頻的直線部分（相當于擴散控制的過程），每層的電子傳遞情況用電阻來表示，可通過計算半圓部分的半徑而得到，半圓的直徑越大所對應電子傳遞的阻力越大，因此可以通過監(jiān)控半圓的直徑變化來監(jiān)控電極的修飾過程[19]。

由圖3可見，經(jīng)過修飾后的金電極（b、c、d）與裸金電極（a）相比，阻抗都有所增加。表明電子傳遞效率最高，裸金電極阻抗最小。當加入Ab1后（b），阻抗增大。是由于Ab1的存在阻礙了氧化還原探針在電極上的電子傳遞，使得Ab1修飾的金電極的電阻與裸金電極的電阻相比有所增加。當再加入hIgG后（d），由于抗體分子在電極表面形成了一層阻礙電子傳遞的屏障，使得電子傳遞的效率明顯降低，從而導致阻抗進一步增大。當繼續(xù)加入Ab2-AuNPs-B后（c），阻抗值要小于d曲線，這是由于B-AuNPs-Ab2上標記了AuNPs，使電子傳遞效率增大，高頻區(qū)半徑減小，阻抗減小。

2.3試驗條件的優(yōu)化

本試驗考察了免疫分析的結(jié)合時間以及包被抗原的濃度。如圖4-A所示，較少體積的Ab1不能夠確保有足夠的抗體進行免疫反應，使得測定的信號值較低；相反，Ab1的用量為0.1 mg/L時，測定信號有顯著提高。此外，Ab1與hIgG的結(jié)合時間也是影響免疫傳感器信號的重要因素。如圖4-B 所示，當Ab1結(jié)合到電極上的時間為45 min時，免疫傳感器的信號值最大。如圖4-C所示，電化學響應隨著免疫時間的延長而增加，當免疫時間為40 min時，免疫傳感器的電化學響應達到最大值，當繼續(xù)延長反應時間時，響應并未有明顯增大。因此分別選擇45、40 min為最優(yōu)時間。

2.4目標物分析檢測結(jié)果

本試驗采用循環(huán)伏安法（CV）和差示常規(guī)脈沖伏安法（DNPV）優(yōu)化反應條件，對hIgG進行檢測（圖5）。圖5-A、圖5-B是不同修飾電極表面的循環(huán)伏安曲線和差示脈沖伏安曲線。由圖5可以看出，當Ab2-AuNPs-B結(jié)合到hIgG上后，有1對二茂鐵的氧化還原峰出現(xiàn)，信號明顯增強，說明

納米金修飾的生物條形碼具有很好的信號放大作用。由于差示常規(guī)脈沖伏安法所檢測的電化學信號強于循環(huán)伏安法檢測的峰電流信號。因此選用差示常規(guī)脈沖伏安法對hIgG峰電流值進行檢測，并作標準曲線。隨著hIgG濃度的減小，峰電流值隨之減小，在一段濃度范圍內(nèi)有很好的線性關系。檢測hIgG所得結(jié)果：回歸方程為I（μA）=2.77 lgCIgG+27.75，相關系數(shù)r=0.99，其線性范圍為0.003 2～ 31 μg/L，檢出限為0.004 μg/L，遠低于基于碳納米管固定抗原的檢測方法[20]的檢測限2 μg/L與基于金納米棒標記免疫分析方法[21] 的檢測限25 μg/L。可能原因是：首先，由于納米金粒子具有粒徑小、比表面積大、表面反應活性高、催化效率高等優(yōu)異性[22-23]，能有效結(jié)合一端修飾有巰基的條形碼；其次，每個納米粒子上都結(jié)合了成百上千個生物條形碼，采用DNPV法能夠有效地捕捉這些條形碼另一端標記的二茂鐵的信號，使得電化學信號得以放大；最后，采用BSA封閉金電極，可有效降低傳感器的非特異吸附，避免了其他相關干擾。

2.5傳感器的特異性及重現(xiàn)性

特異性和重現(xiàn)性是考察傳感器的重要因素。本研究考察了免疫傳感器對干擾蛋白如癌胚抗原、肌紅蛋白（Mb）以及BSA的電化學響應。結(jié)果表明，當檢測物含有1.0 μg/L hIgG及2 μg/L BSA、肌紅蛋白、癌胚抗原時，電化學免疫分析方法測定的結(jié)果如圖6所示。由此可以看出此免疫傳感器具有良好的特異性。

將制備的免疫傳感器保存于4 ℃下，每隔5 d進行測試。在 5 d 后，電流值僅減小了4.1%。20 d后電流響應值為原來的89.8%。試驗結(jié)果表明，此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。于同一條件下，用5只金電極對同一濃度hIgG（1 ng/mL）做相關分析，檢測結(jié)果見表1，測定結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為 6.4%。

3結(jié)論

本試驗研究了高靈敏的電化學免疫傳感器。結(jié)合了電化學方法與生物條形碼技術，采用夾心型模式對hIgG進行了檢測 。 此傳感器利用納米金比表面積和良好的導電性，條形碼放大信號的優(yōu)點，極大地提高了靈敏度 。此免疫傳感器檢出限低，穩(wěn)定性好，可望用于其他生化物質(zhì)的檢測。

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