栗方 李志榮 趙穎 趙建宏 張延海 董愛英 劉金祿 郭彥言 孫艷 趙文申 謝守軍0 魏宏蓮 張金艷 任宏濤 王建升 吳相錕 光曉 劉冬青 杜紅麗 郭映輝徐英春 肖盟 楊文航 徐曉琳

(1.河北燕達(dá)醫(yī)院感染與疾病控制部，廊坊 065201；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院感染與微生物科，北京 100020；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 河北省臨床檢驗(yàn)中心，石家莊 050000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科 侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730；4.河北燕達(dá)醫(yī)院，廊坊 065201；5.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山 063000；6.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，張家口 075000；7.河北省唐山市工人醫(yī)院，唐山 063000；8.滄州市中心醫(yī)院，滄州 061001；9.邯鄲市中心醫(yī)院，邯鄲 056001；10.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，承德 067000；11.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊 050000；12.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050019；13.邢臺市人民醫(yī)院，邢臺 054001；14.河北省人民醫(yī)院，石家莊 050057；15.河北省武安市第一人民醫(yī)院，武安 056300；16.邯鄲市第一醫(yī)院，邯鄲 056002；17.衡水市人民醫(yī)院，衡水 053000；18.河北省兒童醫(yī)院，石家莊 050030)

近年來，由于廣譜抗生素、動靜脈置管和其他插管、免疫抑制劑、腫瘤化療藥長期應(yīng)用等因素，侵襲性真菌感染呈逐年增加趨勢[1]。尤其是念珠菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染的主要病原菌[2]，主要原因是患者免疫力下降，引起正常菌群失調(diào)導(dǎo)致念珠菌大量繁殖而致病[3]。據(jù)報道，成年人和新生兒的念珠菌血流感染病死率分別為15%～25%和10%～15%[4]。進(jìn)一步研究顯示[5-7]，念珠菌感染可延長住院時間,增加醫(yī)療成本。一些報道顯示，念珠菌耐藥可導(dǎo)致治療困難[8-9]。由于氟康唑等三唑類藥物的廣泛應(yīng)用，侵襲性酵母樣真菌的菌譜也發(fā)生了變化，對唑類不敏感的非白念珠菌感染的發(fā)生率正在不斷升高。加強(qiáng)本地區(qū)的真菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，對指導(dǎo)臨床合理用藥至關(guān)重要[10]。本研究對河北地區(qū)2016-2017年侵襲性酵母樣真菌的分布和體外藥敏特點(diǎn)進(jìn)行分析總結(jié)，報道如下。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2016-2017年河北地區(qū)16家三級教學(xué)醫(yī)院門診和住院患者體內(nèi)分離的侵襲性酵母樣真菌菌株共計260株。標(biāo)本類型包括：血液、無菌體液(腦脊液、胸水、腹水、膽汁、關(guān)節(jié)液等)、膿腫(穿刺液)、組織、介入性操作標(biāo)本(肺泡灌洗液、保護(hù)性毛刷)；剔除標(biāo)本類型：痰標(biāo)本及氣管吸取物、尿標(biāo)本及生殖道分泌物、同一患者7 d內(nèi)同一部位重復(fù)分離的菌株。

1.2 主要儀器與試劑

沙堡弱培養(yǎng)基、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(Chromagar)、VITEK-2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)、VITEK MS 微生物質(zhì)譜儀(安圖實(shí)驗(yàn)儀器鄭州有限公司)、無菌U型96孔板(江蘇省海門盛泰實(shí)驗(yàn)器材廠)、Sensititre YeastOne藥敏板及接種肉湯(賽默飛世爾科技公司)，全自動加樣器Sensititre AIM(賽默飛世爾科技公司)。

1.3 菌種鑒定

菌株分離采用顯色培養(yǎng)基、VITEK-2 Compact YST、美華真菌鑒定板、珠海迪爾真菌鑒定板進(jìn)行常規(guī)鑒定。中心實(shí)驗(yàn)室對所有菌株進(jìn)行Vitek MS復(fù)核鑒定。對于Vitek MS不能有效鑒定的疑難和罕見菌株，進(jìn)行核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和/或鈣調(diào)蛋白CaM區(qū)PCR擴(kuò)增測序分析[11]。

1.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用商品化的藥敏板條Sensititre YeastOne 對9種抗真菌藥進(jìn)行MIC值的測定。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，藥敏折點(diǎn)依據(jù)CLSI M60進(jìn)行判定[12-13]敏感(S)、耐藥(R)。白念珠菌：氟康唑S≤2,R≥8、伊曲康唑和伏立康唑均為S≤0.12,R≥1、棘白菌素類(阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈)均為S≤0.25,R≥1；熱帶念珠菌：氟康唑S≤2,R≥8、伏立康唑S≤0.12,R≥1、棘白菌素類(阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈)均為S≤0.25,R≥1；近平滑念珠菌：氟康唑S≤2,R≥8、伏立康唑S≤0.12,R≥1、棘白菌素類(阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈)均為S≤2,R≥8；光滑念珠菌：氟康唑SDD≤32,R≥64、阿尼芬凈和卡泊芬凈均為S≤0.12,R≥0.5、米卡芬凈S≤0.06,R≥0.25。以上藥敏MIC值的單位為μg/mL。目前還有一些抗菌藥物沒有對特定菌株的判定折點(diǎn)。

1.5 參考菌株及質(zhì)控菌株

白念珠菌ATCC90028，近平滑念珠菌ATCC22019，克柔念珠菌ATCC6258。

1.6 診斷標(biāo)準(zhǔn)

侵襲性真菌病的診斷參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) WS/T497-2017《侵襲性真菌病臨床實(shí)驗(yàn)室操作指南》。根據(jù)患者宿主因素、臨床特征和微生物學(xué)檢查，將侵襲性真菌病(IFD)診斷為確診、擬診和疑似[14]。通過回顧性分析，利用HIS系統(tǒng)和LIS系統(tǒng)及WHONET軟件調(diào)取患者病歷資料。根據(jù)臨床診斷和檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合2001年《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》做出診斷。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 檢出情況

2016～2017年參與本研究的16家醫(yī)療機(jī)構(gòu)共收集侵襲性酵母樣真菌菌株260株。其中白念珠菌占42.31%，其次是熱帶念珠菌19.23%、近平滑念珠菌復(fù)合體18.08%，見表1。

2.2 標(biāo)本類型

侵襲性酵母樣真菌共計260株，其中來自血液標(biāo)本130株占50.00%，無菌體液標(biāo)本占50.00%，主要包括腹水18.08%、胸水10.77%、膿腫穿刺液6.15%、腦脊液5.00%、膽汁3.85%，見表2。

2.3 不同標(biāo)本類型分離的主要病原真菌(見表3)。

表1侵襲性酵母樣真菌檢出構(gòu)成比

Tab.1Distribution of the isolated yeast strains

病原菌株數(shù)(n=260)構(gòu)成比(%)白念珠菌11042.31%熱帶念珠菌5019.23%近平滑念珠菌復(fù)合體4718.08%光滑念珠菌249.23%新生隱球菌83.08%葡萄牙念珠菌41.54%季也蒙念珠菌41.54%克柔念珠菌41.54%阿薩希毛孢子菌31.15%費(fèi)比恩念珠菌20.77%日本毛孢子菌10.38%果生念珠菌10.38%解脂念珠菌10.38%長路德酵母菌10.38%合計260100%

表2侵襲性酵母樣真菌標(biāo)本類型分布

Tab.2Distribution of clinical specimens

標(biāo)本類型株數(shù)(n=260)構(gòu)成比(%)血液13050.00%腹水4718.08%胸水2810.77%膿腫穿刺液166.15%腦脊液135.00%膽汁103.85%肺泡灌洗液93.46%導(dǎo)管尖端51.92%組織10.38%羊水10.38%合計260100%

表3血液標(biāo)本和無菌體液標(biāo)本檢出構(gòu)成比

Tab.3Distribution of isolates from bloodstream specimens and other sterile body fluid specimens

病原菌血液標(biāo)本無菌體液標(biāo)本菌株數(shù)構(gòu)成比%菌株數(shù)構(gòu)成比%白念珠菌4030.77%7053.85%熱帶念珠菌2821.54%2216.92%

(續(xù)表)

*包括克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、阿薩希毛孢子菌、費(fèi)比恩念珠菌等。

2.4 藥敏試驗(yàn)

采用Sensititre YeastOne藥敏板條對9種臨床常見的抗真菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，見表4。

3 討 論

我們的研究結(jié)果表明，在侵襲性酵母樣真菌感染中白念珠菌是最常見的致病菌，占42.31%，非白念珠菌明顯增加，已經(jīng)超過白念珠菌，占50%以上。近年來研究報道[15-16]：真菌感染的構(gòu)成有所變化，在念珠菌中，白念珠菌始終占主要地位，但檢出

表4 260株侵襲性酵母樣真菌體外藥敏試驗(yàn)分析

(續(xù)表)

*MIC50: 50% minimal inhibitory concentration; MIC90: 90% minimal inhibitory concentration

—：目前沒有針對該菌株的藥敏判定折點(diǎn)率下降，非白念珠菌比例上升，我們的研究與文獻(xiàn)報道一致。白念珠菌因其菌絲形成較快且多，不易被吞噬，且能分泌溶血磷脂酶和磷脂酶A，保護(hù)自身免受外界侵害，導(dǎo)致其感染率較高。

在1997～2007年一項(xiàng)全球監(jiān)測顯示：90%以上的念珠菌感染是由白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌4種念珠菌引起的[17]。CHIF-NET 2010～2014年中國多中心侵襲性酵母樣真菌感染的研究報道[18]：白念珠菌仍是最常見的菌種，占44.9%，但非白念珠菌超過50%，其中近平滑念珠菌復(fù)合體20.0%、熱帶念珠菌17.2%、光滑念珠菌復(fù)合體10.8%。我們的研究結(jié)果顯示：白念珠菌占42.31%，其次是熱帶念珠菌19.23%、近平滑念珠菌復(fù)合體18.08%、光滑念珠菌9.23%，與國內(nèi)、外報道基本一致。

本研究的標(biāo)本類型主要包括血液和無菌體液，其中血液占50.00%，其次是腹水18.08%、胸水10.77%、膿腫穿刺液6.15%、腦脊液5.00%和膽汁3.85%。CHIF-NET 2011～2014年中國多中心侵襲性酵母樣真菌的研究報道[18]，血液標(biāo)本占42.6%，其次為腹水標(biāo)本及膿腫。我們的結(jié)果與報道基本一致。

CHIF-NET 2010～2014年中國多中心侵襲性酵母樣真菌研究中，白念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率不到1%，近平滑念珠菌復(fù)合體對氟康唑和伏立康唑的耐藥率為9.2%和2.5%。光滑念珠菌復(fù)合體對氟康唑和伏立康唑的耐藥率為19.0%和18.7%。熱帶念珠菌對唑類藥物的耐藥率高達(dá)20%[18]。我們研究顯示：所有抗真菌藥物對白念珠菌均有很高的敏感性，白念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別為2.8%和1.9%；熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率均為12.8%；近平滑念珠菌復(fù)合體對氟康唑和伏立康唑的耐藥性為14.9%和10.6%；白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌對棘白菌素類抗真菌藥幾乎全敏感；我們的研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道[18]基本一致。光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率為4.2%，可能與收集的菌株數(shù)量較少和地域分布有關(guān)。我們研究中發(fā)現(xiàn)了交叉耐藥，特別是熱帶念珠菌和近平滑念珠菌對氟康唑耐藥也預(yù)示對伏立康唑耐藥，這個發(fā)現(xiàn)與其他研究相似[19]。檢索國內(nèi)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，不同醫(yī)院唑類藥物的耐藥率數(shù)據(jù)有較大變化，與全國真菌監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)有顯著差異[18]。念珠菌對唑類藥物常見的耐藥機(jī)制為外排泵的表達(dá)和編碼靶酶基因突變，外排泵CDR1(念珠菌耐藥基因)的過度表達(dá)是導(dǎo)致白念珠菌對唑類耐藥的主要機(jī)制。真菌耐藥雖然沒有達(dá)到細(xì)菌耐藥的嚴(yán)重程度，但可用的抗真菌藥物相對匱乏，所以真菌的耐藥性是決定抗菌藥物療效的重要因素。

侵襲性酵母樣真菌感染是一個持續(xù)的公共健康問題。我們的結(jié)論可能會影響河北地區(qū)的病原菌管理、感染控制政策。侵襲性酵母樣真菌感染有全球規(guī)模，更重要的是本地水平，所以持續(xù)監(jiān)測流行病學(xué)和體外藥敏結(jié)果尤為重要。本研究是基于河北地區(qū)的一項(xiàng)多中心參與的侵襲性真菌感染監(jiān)測項(xiàng)目，可為臨床診治、改善患者預(yù)后、降低患者死亡率提供參考數(shù)據(jù)。