蔡晴 楊連娟 高志琴 任弘瑾 楊虹 譚靜文

(上海市皮膚病醫(yī)院真菌病科，上海 200050)

侵襲性念珠菌感染的發(fā)病率逐年增高，白念珠菌的耐藥現(xiàn)象也日趨嚴(yán)峻[1]，尋找合理、有效的治療手段是臨床中亟需解決的問(wèn)題。有學(xué)者提出，染色體的修飾異常可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的可逆性耐藥，白念珠菌的耐藥機(jī)制與腫瘤細(xì)胞有類似之處，如外排泵功能的活躍[2-3]。有個(gè)別研究提示組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑可增加白念珠菌對(duì)三唑類藥物的敏感性[4-5]。羅米地辛是一種雙環(huán)肽類的HDAC抑制劑，美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和外周T細(xì)胞淋巴瘤。本研究以Rpd3選擇性抑制劑羅米地辛為研究對(duì)象，觀察其對(duì)氟康唑抗白念珠菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株4株(ATCC 90028，ATCC 64550，ATCC 62342，ATCC 44505，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)微生物菌(毒)種保藏管理中心真菌中心惠贈(zèng)，我院門診收集白念珠菌臨床株11株(C2、C7、C9、C14、C15、C54、C63、C66、C73、N168、N175)，均經(jīng)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基及ITS序列分子鑒定。質(zhì)控株為克柔念珠菌ATCC 6258。

1.2 試驗(yàn)藥物

氟康唑藥粉(批號(hào)：S1331，純度>99%)，用滅菌蒸餾水配置成1280μg/mL。HDAC抑制劑Rpd3選擇性抑制劑：羅米地辛溶液(批號(hào):S3020，濃度10 mmol/L)。以上藥物均購(gòu)自Selleck公司，放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 氟康唑?qū)Π啄钪榫捏w外敏感性檢測(cè)

參考CLSI的M27-A3方案[6]配制RPMI 1640培養(yǎng)基及藥液。氟康唑在96孔板上第1～10列藥物濃度范圍為64～0.125 μg/mL。將藥物的原液稀釋至2倍受試終濃度，取100μL藥液加入受試孔，第11列及第12列加入不含藥的RPMI 1640培養(yǎng)基，作為生長(zhǎng)對(duì)照孔及空白對(duì)照孔。通過(guò)麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整受試菌接種終濃度約為1×103CFU/mL，加入含有藥液的平板，置于35℃培養(yǎng)箱孵育48 h。分別記錄MIC值(肉眼觀察與生長(zhǎng)孔比較抑制50%生長(zhǎng)程度的藥物濃度)和拖尾程度(48 h時(shí)無(wú)菌生長(zhǎng)孔的藥物濃度)，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD630nm的吸光值。上述檢測(cè)均平行三孔，隔日重復(fù)兩次。

1.4 羅米地辛對(duì)氟康唑抗白念珠菌活性的影響

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅米地辛單獨(dú)作用沒(méi)有抗白念珠菌活性，通過(guò)棋盤法篩選出兩個(gè)濃度分析羅米地辛對(duì)氟康唑抗白念珠菌活性的影響。96孔板中第1列至第10列氟康唑濃度為64～0.125 μg/mL(50 μL)，并在不同的板中分別加入2 μg/mL和4 μg/mL的羅米地辛(50μL)，第11列及第12列分別作為生長(zhǎng)對(duì)照和空白對(duì)照。加入受試菌菌液，置于35℃培養(yǎng)箱孵育48 h。分別記錄MIC值和拖尾程度，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值。上述檢測(cè)均平行3孔，隔日重復(fù)2次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件，將MIC值換算為對(duì)數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試菌株體外抗真菌藥物敏感性

各受試白念珠菌菌株對(duì)氟康唑的體外敏感性見(jiàn)表1。參考CLSI的M27-S4折點(diǎn)[7]，受試菌株中氟康唑敏感株、劑量依賴株、耐藥株各5株，MIC范圍在0.25～32 μg/mL。

2.2 羅米地辛對(duì)氟康唑抗白念珠菌活性的影響

羅米地辛可以增加氟康唑的抗真菌作用：加入2 μg/mL的羅米地辛后，2株受試菌MIC值降低，加入4 μg/mL的羅米地辛后，8株受試菌MIC值降低。兩組MIC值與單用氟康唑分別比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 氟康唑及氟康唑聯(lián)合羅米地辛對(duì)白念珠菌的體外抗真菌藥物敏感性

羅米地辛可以減少氟康唑的拖尾現(xiàn)象：計(jì)算48 h無(wú)菌生長(zhǎng)孔藥物濃度與24 h MIC值的比值，比值越高代表拖尾現(xiàn)象越明顯。將結(jié)果做熱點(diǎn)圖進(jìn)行分析，可以觀察到加入羅米地辛后，受試菌株中8株比值明顯減低，說(shuō)明羅米地辛減少了氟康唑的拖尾現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

圖1羅米地辛對(duì)氟康唑抗白念珠菌拖尾現(xiàn)象的影響。抑制拖尾現(xiàn)象通過(guò)計(jì)算：48 h無(wú)菌生長(zhǎng)孔藥物濃度與24 h MIC值的比值，將比值做熱點(diǎn)圖。加入羅米地辛后，48h時(shí)受試白念珠菌的拖尾現(xiàn)象明顯減少

Fig.1Effects of romidepsin on trailing growth with fluconazole. The inhibition of trailing growth was evaluated by the ratio of the highest concentration with no sign of growth at 48 h to the MIC value at 24 h. The addition of romidepsin reduced the trailing growth of C.albicans strains at 48h

羅米地辛可以減少測(cè)試孔菌量：以敏感株ATCC 44505、劑量依賴株C7和耐藥株C63作為代表菌株進(jìn)行分析，其吸光度的折線圖表明，與單獨(dú)用氟康唑比較，高濃度藥物孔加入羅米地辛后可以明顯減少測(cè)試孔菌量，羅米地辛增加了氟康唑的抑菌活性。見(jiàn)圖2。

3 討 論

目前，表觀遺傳學(xué)的相關(guān)研究在腫瘤性疾病、免疫相關(guān)疾病中已廣泛開(kāi)展，醫(yī)學(xué)真菌方面報(bào)道相對(duì)較少。對(duì)于白念珠菌，乙?；揎椵^甲基化修飾的作用更為重要[8]。組蛋白的乙酰化修飾與兩種酶密切相關(guān)，組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶和HDAC。通過(guò)影響組蛋白及非組蛋白乙?；倪^(guò)程，HDAC在基因表達(dá)調(diào)控方面具有極為重要的作用，被視為是環(huán)境信號(hào)與細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的中樞接點(diǎn)[9]。HDAC可以將乙?；鶑慕M蛋白H3、H4的N末端賴氨酸殘基上移去，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得相對(duì)致密，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子不易接近DNA，從而抑制基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑具有抗腫瘤的作用，并已應(yīng)用于臨床，如美國(guó)上市的伏立諾他、羅米地辛及我國(guó)的西達(dá)本胺[10-11]?；诙嗨幠退帣C(jī)制的相似性(如腫瘤細(xì)胞耐藥和真菌耐藥均與外排泵的過(guò)度表達(dá)相關(guān))，并隨著白念珠菌表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化修飾與白念珠菌的表型、毒力、體外敏感性及耐藥性均有一定相關(guān)性[4,5,12]。

圖248 h時(shí)羅米地辛對(duì)氟康唑抗白念珠菌菌量生長(zhǎng)的影響。a. ATCC 44505;b. C7;c. C63?！鳎悍颠蚪M吸光度，○：氟康唑加2 μg/mL羅米地辛吸光度，□：氟康唑加4 μg/mL羅米地辛吸光度

Fig.2Effects of romidepsin on fluconazole activities and growth ofC.albicansstrains at 48h. a. ATCC 44505; b. C7; c. C63. △: absorbance of fluconazole, ○: absorbance of fluconazole with 2μg/mL romidepsin, □: absorbance of fluconazole with 4μg/mL romidepsin

羅米地辛是由紫色色桿菌提取合成的一種縮酚酸肽類天然產(chǎn)物，屬于雙環(huán)肽類的HDAC抑制劑，現(xiàn)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)和外周T細(xì)胞淋巴瘤(PCTL)[13-14]。對(duì)于酵母菌，HDAC主要分為3類，Ⅰ類以Rpd3為代表，Ⅱ類以Hda1為代表，Ⅲ類以Sir2為代表。羅米地辛是一種Rpd3選擇性抑制劑，主要抑制Ⅰ類HDAC，包括HDAC1和HDAC2[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，曲古菌素a對(duì)唑類藥物的抗真菌活性有增效作用，但是該藥僅能作為試驗(yàn)用藥，且是非選擇性的HDAC抑制劑[5]。相對(duì)于曲古菌素a，羅米地辛更具有靶向性，且已經(jīng)在臨床中應(yīng)用，更具有研究和實(shí)用價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)羅米地辛對(duì)氟康唑的體外活性有增效作用，主要表現(xiàn)在MIC值降低、菌量減少和抑制拖尾現(xiàn)象，對(duì)敏感株、劑量依賴株和耐藥株均有一定作用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；揎椗c白念珠菌的體內(nèi)外獲得性氟康唑耐藥密切相關(guān)[5]。組蛋白去乙?；揎椬鳛樯嫌螜C(jī)制對(duì)白念珠菌的唑類藥物獲得性耐藥有調(diào)節(jié)作用。組蛋白去乙?；揎椏稍讷@得性氟康唑耐藥形成早期通過(guò)對(duì)白念珠菌外排泵的調(diào)控來(lái)誘導(dǎo)耐藥形成：耐藥形成過(guò)程中，HDA1和RPD3表達(dá)水平均在早中期升高，穩(wěn)定耐藥形成后降低，而CDR1和CDR2表達(dá)水平變化與其同向。由于組蛋白去乙酰化可使被修飾的DNA或染色質(zhì)空間構(gòu)型更為緊密，抑制基因的表達(dá)，鑒于此，我們推測(cè)組蛋白去乙?；揎棽⒉皇侵苯幼饔糜谕馀疟没?，中間可能涉及多個(gè)通路、轉(zhuǎn)錄因子，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，羅米地辛作為Rpd3選擇性抑制劑對(duì)氟康唑抗白念珠菌活性有增效作用，對(duì)其深入研究有助于我們進(jìn)一步闡明白念珠菌耐藥的發(fā)生機(jī)制以及尋找新的藥物靶點(diǎn)均有重要意義。

致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院真菌科劉維達(dá)教授對(duì)本文提供的幫助！