史芮源，曹文紅，2，張雨婕，黃銳鑫，劉珍妮

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋生物制品工程實驗室/廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【研究意義】由于水產(chǎn)品高蛋白、低脂肪、高水分的特性，冷凍保藏是水產(chǎn)品加工保藏過程中的主要方式，而在此期間發(fā)生的蛋白質(zhì)冷凍變性是導(dǎo)致其品質(zhì)下降的主要原因［1］，目前最為有效的避免水產(chǎn)品冷凍變性的措施是添加抗凍保護劑，常用的抗凍劑有蔗糖、多聚磷酸鹽、海藻糖等［2］。蔗糖會使產(chǎn)品帶有甜味，且對肥胖者、糖尿病、高血糖患者等特殊人群產(chǎn)生不利影響，磷酸鹽過多攝入對人體鈣質(zhì)的吸收也有一定影響。食源性的抗凍保護劑則可以有效避免這些問題，利用魚皮開發(fā)新的抗凍保護劑，既可以提高魚類的附加價值，解決魚皮浪費問題，又能為進一步研究蛋白型抗凍劑提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】林嫻萍等［3］對鮐魚肉酶解產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，其對帶魚魚糜蛋白的冷凍變性有良好的抑制效果；劉永樂等［4］研究發(fā)現(xiàn)鯰魚復(fù)合蛋白酶酶解物具有一定抗凍保護效果；張怡等［5］探究了堿性蛋白酶對金線魚魚皮進行酶解的最優(yōu)條件，并對其理化性質(zhì)進行探究；DU等［6］研究了雞皮膠原蛋白水解物對天然肌動球蛋白的抗凍保護作用，發(fā)現(xiàn)其具有減緩蛋白質(zhì)冷凍變性和氧化作用；束玉珍等［7］對鮐魚肉酶解物進行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗凍保護作用?！颈狙芯壳腥朦c】有關(guān)研究表明，食品蛋白質(zhì)水解物多肽，尤其是水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中的衍生多肽，可以有效抑制水產(chǎn)品在冷凍保藏過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)冷凍變性，且冷凍保護效果可與傳統(tǒng)抗凍劑媲美，避免傳統(tǒng)抗凍劑存在的危害，使得魚類副產(chǎn)物得到充分利用［8］。不同魚源的酶解條件可能具有較大差異，羅非魚作為消耗量極大的品種，未見利用其魚皮開發(fā)抗凍保護劑的相關(guān)報道，需進行酶解條件的優(yōu)化，同時對其抗凍保護活性進行評估。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用羅非魚魚皮酶解制得酶解產(chǎn)物，對酶解時的溫度、酶添加量、pH值與時間進行探究，并以羅非魚魚片為實驗對象，對比酶解產(chǎn)物與含磷抗凍保護劑對其保水性、Ca2+-ATPase 活性、鹽溶性蛋白與巰基含量的影響差異，以期為開發(fā)新型食源性抗凍保護劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年5～8月在廣東海洋大學(xué)廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室及水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室進行。

材料與試劑：羅非魚冷凍魚皮，購于湛江國聯(lián)水產(chǎn)有限公司；新鮮羅非魚，購于湛江霞山東風(fēng)市場；堿性蛋白酶（來源為微生物，2.4 AU/g），購于諾維信（中國）生物科技有限公司；維生素B12（1 355.38 u）、溶菌酶（14 300 u）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（429.47 u）、L-酪氨酸（181.19 u），購于美國Sigma公司。

儀器：CR22GLL臺式高速冷凍離心機，長沙英泰儀器有限公司；VULCAN.3-550PD.馬弗爐，美國VULCAN公司；FDU-1100真空冷凍干燥機，埃朗科技國際貿(mào)易有限公司；PHS-25C精密pH計，上?？祪x儀器股份有限公司； HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；N-1100V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海埃朗儀器有限公司；LC20AD高效液相色譜，日本島津公司；UV2550紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅非魚魚皮酶解產(chǎn)物的制備 冷凍魚皮于室溫解凍，去魚鰭、魚鱗以及與魚皮粘連的魚肉，清水洗凈后切成細條狀，脫脂后2.5% 氯化鈉溶液處理10 h，瀝干后加入1∶1的去離子水熱燙軟化，然后搗碎成魚漿，1∶1加入去離子水，攪拌15 min，然后加入一定量的堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH、溫度進行酶解，酶解一定時間后，將酶解液轉(zhuǎn)移至100 ℃熱水中滅活15 min，8 000 r/min冷凍離心20 min后，取上清液于0.1 MPa真空度、50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥箱干燥后備用。

1.2.2 酶添加量、溫度、pH值對魚皮酶解的影響 單因素試驗各設(shè)置5個處理，分別為酶添加量（堿性蛋白酶占魚皮的百分數(shù)）0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%；溫度55、60、65、70、75 ℃；pH值6.5、7.0、7.5、8.0，3次重復(fù)，通過計算酶解液的水解度比較酶解效果，選取最優(yōu)酶添加量、溫度、pH值進行正交試驗。

1.2.3 酶解條件的優(yōu)化 選取不同酶添加量、溫度、pH對羅非魚魚皮酶解產(chǎn)物進行反應(yīng)條件的單因素影響研究（表1），通過計算酶解液的水解度比較酶解效果，選取最優(yōu)的酶添加量、反應(yīng)溫度、pH，進行3因素3水平正交優(yōu)化試驗。

表1 羅非魚魚皮皮水解試驗因素水平Table 1 Levels of factors for the hydrolysis test of tilapia skin

1.2.4 水解度的測定方法 運用凱氏定氮法測原料中的總氮量［9］；使用甲醛滴定測酶解液中游離氨基態(tài)氮含量［10］。水解度平行測定3次。

1.2.5 酶解產(chǎn)物肽分子量測定 參照文獻［11］的方法，稍做修改，使用高效體積排阻色譜法（HPSEC）測定酶解產(chǎn)物分子量分布狀況。色譜條件：流動相為Tris-HCl緩沖液（pH 8.3、濃度0.05 mol/L）；色譜柱：Waters Protein-pak 60A（WAT085250）；0.7 mL/min的洗脫速度；25 ℃柱溫；加20 μL樣品，樣品濃度稀釋到100 μg/mL；214 nm波長進行檢測。標準品分別為：維生素B12（1 355.38 u）、溶菌酶（14 300 u）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（429.47 u）、L-酪氨酸（181.19 u）。以分子量的對數(shù)lgM為縱坐標、保留時間(t)為橫坐標，得到分子量回歸方程：lgM=-0.4567t+8.9462(R2=0.9976)。

1.2.6 凍藏羅非魚魚片的處理

（1）洗凈新鮮羅非魚，去魚頭、魚鰭、魚尾和內(nèi)臟后再次用清水洗凈，此過程溫度控制在10 ℃左右。（2）魚肉片和皮、骨分離后將魚肉切成均勻的薄片并均等分入小燒杯中，分成3個處理：以魚片重量的0.5%加入復(fù)合磷酸鹽抗凍劑為含磷抗凍劑處理、以魚片重量的5%加入羅非魚皮酶解產(chǎn)物為酶解產(chǎn)物處理、無任何添加為空白對照。（3）于-75℃冰箱凍藏2 h再轉(zhuǎn)移至-18℃中凍藏，而后取樣測定凍藏過程中的各項冷凍保護活性生化指標。

1.2.7 酶解產(chǎn)物冷凍保護作用研究 （1）失水率測定。參考俞裕明［12］的方法，在冷藏0、1、2、3、4、6周測定羅非魚魚片失水率，3次重復(fù)。

（2）鹽溶性蛋白制備及測定。參照萬建榮［13］方法稍作修改：稱取3 g解凍后的羅非魚魚片加入磷酸鹽緩沖液（I=0.05，pH=7.5）30 mL進行研磨，研磨5 min后于4 ℃、8 000 r/min冷凍離心15 min，重復(fù)2次，取沉淀物，向其中加入30 mL氯化鈉溶液（pH=7.0，0.6 mol/L），0～4 ℃提取20 h后于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，取上清液測定。采用Follin酚法測定上清液蛋白質(zhì)含量（鹽溶性蛋白含量），凍藏0、1、2、3、4、6周檢測羅非魚魚片鹽溶性蛋白含量，3次重復(fù)。

（3）Ca2+-ATPase酶活測定。根據(jù)超微量Ca2+-ATPase測試盒的方法和步驟來測量羅非魚魚片的Ca2+-ATPase酶活，吸光度波長636 nm，光徑0.5 cm，凍藏0、1、2、3、4、6周分別測定1次羅非魚魚片Ca2+-ATPase酶活，3次重復(fù)。Ca2+- ATPase酶活計算公式：

（4）總巰基含量測定。參照BENJAKUL［14］的方法，在冷藏0、1、2、3、4、6周取樣檢測，3次重復(fù)。

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚皮酶解單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶添加量對魚皮酶解的影響 由于酶添加量在某一區(qū)間對蛋白質(zhì)水解作用影響較大，通過預(yù)實驗確定酶添加量區(qū)間為0.1%～0.9%。從圖1可以看出，當(dāng)酶添加量為0.7%時，提取效果最為明顯，水解度值最大、為30.17%。酶添加量為0.5%、0.9%時，水解度分別為27.64%、29.58%，正交試驗時酶添加量選用0.5%、0.7%、0.9%。

圖1 酶添加量對羅非魚魚皮酶解的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on the enzymatic hydrolysis of tilapia skin

2.1.2 溫度對魚皮酶解的影響 溫度可能對酶解作用時酶與底物的結(jié)合方式產(chǎn)生作用，造成酶解產(chǎn)物成分不同。從圖2可以看出。溫度為65 ℃時，魚皮酶解產(chǎn)物水解效果最明顯，水解度達到31.05%，溫度為55、60 ℃時，水解度分別為26.64%、30.17%，大部分蛋白酶的最佳溫度在40～60 ℃，酶活性在低溫下受到抑制，而酶解溫度過高則容易導(dǎo)致酶失活，因此正交試驗時選取的酶解溫度為55、60、65 ℃。

圖2 溫度對羅非魚魚皮酶解的影響Fig.2 Effect of temperature on the enzymatic hydrolysis of tilapia skin

2.1.3 pH值對魚皮酶解的影響 pH值過大或者過小均可能造成酶失活，導(dǎo)致水解度下降，本實驗采用的是堿性蛋白酶，因此選擇pH值較大的區(qū)間進行單因素試驗，結(jié)果見圖3。pH為7.5時，魚皮水解度最大，為35.40%，pH為7.0和8.0時作用效果較好，確定正交試驗時pH值選取7.0、7.5、8.0。

圖3 pH值對羅非魚魚皮酶解的影響Fig.3 Effect of pH on the enzymatic hydrolysis of tilapia skin

2.2 魚皮酶解工藝正交優(yōu)化結(jié)果

酶添加量、溫度、pH值3個因素對堿性蛋白酶的水解產(chǎn)生影響大小不一，需要進行正交試驗，優(yōu)化酶解因素，魚皮酶解條件正交試驗結(jié)果見表2。由表2可知，對酶解產(chǎn)物水解度影響最大的因素是酶添加量（B），極差值為9.95，其次是溫度（A）和pH（C），極差值分別為3.00、2.85，根據(jù)各因素平均水平，得出最佳提取組合為A1B2C2，即溫度55 ℃、酶添加量0.7%、pH7.5。

酶解時間達到一定時，對水解度幾乎沒有影響，時間過長可能使具有抗凍活性的片段失活，因此需探究不同時間對A1B2C2組合水解度的影響，結(jié)果見圖4。0～7 h內(nèi)，隨著酶解反應(yīng)時間增加，水解度也隨之上升，0～3 h內(nèi)，水解度上升趨勢尤為明顯，而4～7 h內(nèi)，水解度無顯著變化，表明在3 h左右酶解反應(yīng)基本完成，因此確定最佳反應(yīng)時間為3 h。

2.3 酶解產(chǎn)物肽分子量分布

酶解產(chǎn)物肽分子量的分布如圖5所示。根據(jù)HPSEC得到的分子量回歸方程，可計算出羅非魚魚皮酶解產(chǎn)物的分子分布情況，結(jié)果見表3。由表3可知，酶解產(chǎn)物肽的分子量主要分布在367.05～6264.80 u，其中分子量在6 264.80 u左右的多肽類占43.71%，367.05 u分子量附近的比重分別為達26.68%。孫麗潔［19］得到的抗凍多肽分子量主要分布在小于3 000 u區(qū)間，目前研究結(jié)果表明抗凍多肽相對分子質(zhì)量較低，具有較強的冷凍保護活性，可能是因為分子質(zhì)量小的多肽更容易與冰晶表面結(jié)合，阻礙冰晶生長，而小分子肽也可以與水形成氫鍵，增強凍結(jié)過程水的穩(wěn)定性，減少大冰晶形成［1］。

表2 酶解正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment result of the enzymatic hydrolysis

圖4 酶解時間對羅非魚魚皮酶解的影響Fig.4 Effect of time on the enzymatic hydrolysis of tialapia skin

2.4 酶解產(chǎn)物冷凍保護效果

2.4.1 凍藏過程中羅非魚魚片失水率變化 魚肉的保水性是判斷冷凍保護效果的重要指標之一，羅非魚魚片失水率在凍藏過程中的變化如圖6所示。凍藏時間延長導(dǎo)致羅非魚魚肉失水率上升，且空白對照上升幅度較復(fù)合磷處理和酶解產(chǎn)物處理大。凍藏4周后，空白對照失水率達到7.38%，含磷抗凍劑處理的失水率為2.16%，酶解產(chǎn)物處理的失水率為2.22%，與含磷抗凍劑處理失水率接近。凍藏6周時，空白對照的失水率仍顯著高于含磷抗凍劑處理組和酶解產(chǎn)物處理。

圖5 羅非魚魚皮酶解產(chǎn)物的HPSEC圖譜Fig.5 HPSEC map of the enzymatic hydrolysate of tilapia skin

表2 酶解正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment result of the enzymatic hydrolysis

圖6 凍藏過程中羅非魚片失水率變化Fig.6 Variation of water loss rate of tilapia fillets during the frozen storage

圖7 凍藏過程中羅非魚片鹽溶性蛋白含量變化Fig.7 Changes of salt soluble protein content in tilapia fillets during the frozen storage

2.4.2 凍藏過程中羅非魚魚片鹽溶性蛋白含量變化 肌原纖維蛋白是魚肉蛋白在凍藏過程主要的變性部分，因此將鹽溶性蛋白含量在凍藏過程中的變化作為評價魚皮酶解產(chǎn)物的冷凍保護作用的指標。如圖7所示，3個處理樣品的鹽溶性蛋白濃度在凍藏1～6周均呈下降趨勢，而空白對照的下降趨勢更為明顯。凍藏1周時，空白對照的鹽溶性蛋白由最初鮮魚鹽溶性蛋白含量為84.13 mg/g下降到31.13 mg/g，含磷抗凍劑處理和酶解產(chǎn)物處理則分別下降到41.18、53.19 mg/g；凍藏1周后，下降幅度減緩；凍藏4周后，含磷抗凍劑處理和酶解產(chǎn)物處理的鹽溶性蛋白含量基本相同。凍藏6周結(jié)束時，空白對照、含磷抗凍劑處理、酶解產(chǎn)物處理鹽溶性蛋白含量分別為4.65、24.02、21.39 mg/g，相比凍藏開始時分別下降了94%、71%、74%，而當(dāng)凍藏時間在1～4周時，酶解產(chǎn)物處理的鹽溶性蛋白質(zhì)含量略高于含磷抗凍劑處理。

2.4.3 凍藏過程中羅非魚魚片Ca2+-ATPase酶活變化 凍藏中形成的冰晶和升高的離子強度使蛋白質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致肌球蛋白球狀頭部的Ca2+-ATPase酶活下降［15］。因此，在凍藏過程中Ca2+-ATPase酶活的變化情況可以作為魚肉冷凍保護效果的指標［7］。羅非魚魚片Ca2+-ATPase酶活凍藏過程中的變化如圖8所示，凍藏開始時，空白對照組酶活下降速度最快，凍藏1周后，3組Ca2+-ATPase酶活分別為0.113、0.1619、0.1661 μmolPi/mgprot·h，分別下降了 45%、21.19%。含磷抗凍劑處理組和酶解產(chǎn)物處理的Ca2+-ATPase酶活下降速度較慢。凍藏結(jié)束時，3組Ca2+-ATPase酶活分別為0.035、0.0429、0.0427 μmolPi/mgprot·h，基本相等，含磷抗凍劑處理組略高。

圖8 凍藏過程中Ca2+-ATPase酶活變化Fig.8 Changes of Ca2+-ATPase activity during the frozen storage

2.4.4 凍藏過程中羅非魚魚片總巰基變化 活性巰基和隱藏性巰基是存在于肌原纖維蛋白中的兩類巰基，活性巰基可分為 SH1、SH2、SHa［15］，肌球蛋白頭部SH1和SH2與Ca2+-ATPase酶活性關(guān)系密切［16］，凍藏時肌原纖維蛋白中活性巰基會被暴露氧化［17］，因此在凍藏過程中總巰基的減少量可以作為蛋白質(zhì)冷凍保護效果的指標［16］。從圖9可以看出，從凍藏開始到結(jié)束，總巰基含量均呈下降趨勢，含磷抗凍劑處理組和酶解產(chǎn)物處理組下降趨勢基本相同，凍藏6周后，空白對照、含磷抗凍劑處理、酶解產(chǎn)物處理的總巰基含量分別為 5.176×10-5、5.265×10-5、5.333×10-5mol/L，分別下降38%、37%、36%，空白對照最低，含磷抗凍劑處理次之，酶解產(chǎn)物處理最高。

圖9 凍藏過程中羅非魚片總巰基含量的變化Fig.9 Changes of total sulfhydryl in tilapia fillets during the frozen storage

3 討論

酶解過程中，酶添加量、反應(yīng)溫度、pH值、酶解時間均會對酶解產(chǎn)物的成分造成很大影響，張怡等［5］對金線魚魚皮酶解優(yōu)化的結(jié)果表明，堿性蛋白酶最佳酶解條件為：底物與酶比例30∶1、時間147 min、溫度50 ℃、pH值9，此條件下的抗凍蛋白得率為49.25（±1.34）%，分子量≥5 000～10 000 u的多肽抗凍效果最佳。洪燕婷等［18］與孫麗潔等［19］對蛋白酶酶解溫度的研究結(jié)果表明，大部分蛋白酶的最佳酶解溫度在40～60℃，汪少蕓等［20］實驗數(shù)據(jù)表明，堿性蛋白酶對魚皮酶解的最佳pH值在7～9，漆嫚等［21］使用胰蛋白酶酶解鱸魚蛋白最佳溫度為40 ℃，李高榮等［22］研究堿性蛋白酶最佳溫度為45 ℃。由于計算方法、實驗原料、堿性蛋白酶的廠家以及原料處理方法不同，且不同魚源的含量與結(jié)構(gòu)有所不同，溫度、酶添加量與pH值對其酶解效果的影響也不相同，優(yōu)化所得溫度較高，反應(yīng)時間較長，酶添加量與pH值均較低。本研究制備的羅非魚魚皮酶解產(chǎn)物分子量主要分布在367.05～6 264.80 u范圍內(nèi)，根據(jù)文獻報道此區(qū)間內(nèi)的多肽物質(zhì)具有較好的冷凍保護活性。

水產(chǎn)品的保水性、Ca2+-ATPase酶活性、鹽溶性蛋白與巰基含量是衡量抗凍劑冷凍保護效果的重要指標，冷凍過程中細胞的損傷是由大冰晶造成，由此引起蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致解凍時汁液流失增加［23］。復(fù)合磷酸鹽抗凍劑能夠使得蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中容納更多的水分子，從而減少魚肉的失水率［24］。而魚源性酶解產(chǎn)物可以阻擋不同水分子之間的位移，從而使冷凍過程中魚肉肌原纖維水分比較穩(wěn)定。束玉珍等［7］對鮐魚肉酶解物進行研究發(fā)現(xiàn)，魚肉酶解產(chǎn)物具有一定的保水性，添加魚肉酶解產(chǎn)物組樣品Ca2+-ATPase酶活性明顯高于空白，多磷酸鹽抗凍劑和魚肉酶解物在不同程度上均有保護活性巰基的作用。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，含磷抗凍劑處理和酶解產(chǎn)物處理的魚片失水率在凍藏過程中減少幅度較低，說明多磷酸鹽抗凍劑和酶解產(chǎn)物對魚肉在凍藏過程中有提高保水性的作用；復(fù)合磷酸鹽和酶解產(chǎn)物可以減緩魚片Ca2+-ATPase酶活性和巰基含量的下降速度，一定程度上抑制蛋白質(zhì)冷凍變性，具有冷凍保護作用，酶解產(chǎn)物處理效果較含磷抗凍處理好。SULTANBAWA［25］研究顯示，-18℃凍藏4個月的藍鰭魚糜蛋白，鹽溶性蛋白含量由60%下降至19%，其中空白對照最為嚴重，多磷酸鹽抗凍劑和酶解產(chǎn)物均可以減緩這種變性，酶解產(chǎn)物的作用效果略優(yōu)。多磷酸鹽具有良好的纖維改善性質(zhì)［26］，可以穩(wěn)定肌原纖維蛋白的構(gòu)象，起到保水的作用，海藻糖等糖類則可以與極性基團結(jié)合，減少結(jié)合水的含量，同時與更多的水分子形成易解離的氫鍵，抑制冰晶的形成［27］，魚皮酶解產(chǎn)物的抗凍保護效果主要源于分布在367.05～6 264.80 u范圍內(nèi)的酶解產(chǎn)物含有大量暴露的羥基等親水基團，可以與水構(gòu)成氫鍵，以增強水的穩(wěn)定性，進而避免魚肉蛋白空間結(jié)構(gòu)的劇烈變化，另一方面酶解產(chǎn)物能夠在一定程度上抑制脂肪的氧化，阻止了魚肉蛋白羰基化合物形成并且有效降低了總巰基損失［28］，但是對于具體是哪些序列的基團具有抗冷凍變性的作用，有待進一步研究探索。

本研究從多方面證明魚皮堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較強的抗凍保護活性，其具體的抗凍活性多肽有待進一步分離純化與鑒定分析。

4 結(jié)論

以羅非魚魚皮為原料，單因素和正交試驗優(yōu)化了堿性蛋白酶酶解羅非魚皮的最佳工藝參數(shù)：溫度55 ℃、酶添加量0.7%、pH7.5；在最佳酶解工藝參數(shù)下所得酶解產(chǎn)物分子量主要集中在367.05～6 264.80 u；以失水率、鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase酶活、總巰基含量為指標顯示，以5%添加量的酶解產(chǎn)物處理對冷凍羅非魚片的冷凍變性保護效果優(yōu)于空白對照和含磷抗凍劑處理，表明以肽為主體的羅非魚皮堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有良好的冷凍保護活性。