黃曉梅 ，蘇秋權(quán) ，李亞菲 ，王威利 ，殷秋妙 ，伍健光 ，吳維煇

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心，廣東 廣州 510640；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（廣州），廣東 廣州 510640；3.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520）

【研究意義】雞蛋的營養(yǎng)主要來源于蛋清與蛋黃，二者的營養(yǎng)價值不同，其相關(guān)制品受到不同人群的青睞。例如，蛋清富含蛋白質(zhì)，是普通人群補充蛋白的重要來源，也是烘焙制品的重要原料；蛋黃是蛋撻、餅干、蛋黃派等產(chǎn)品的理想原料。蛋雞在養(yǎng)殖過程中難免會使用一些獸藥來治療相關(guān)疾病，雞蛋是蛋雞排出獸藥的重要途徑，因此，雞蛋中的獸藥殘留備受關(guān)注。然而，由于蛋清與蛋黃的形成機制不同，可能會導(dǎo)致獸藥在蛋清與蛋黃中的獸藥殘留水平不同。由于蛋清與蛋黃的基質(zhì)不同，其樣品的分析方法存在差異性。例如，在分析磺胺類藥物殘留時，蛋黃樣品經(jīng)提取后需經(jīng)除脂步驟［1］?；前范谆奏け粡V泛應(yīng)用于預(yù)防和治療畜禽類的抗菌和抗球蟲病。但使用磺胺二甲嘧啶后，其在雞蛋中的殘留量很高［2］，因此該藥物說明書明確規(guī)定蛋雞產(chǎn)蛋期禁用。但在生產(chǎn)實踐中，磺胺二甲基嘧啶仍非法用于蛋雞，從而導(dǎo)致雞蛋中藥物殘留時有發(fā)生［3］。本研究以磺胺二甲基嘧啶為例，探討蛋液（蛋清與蛋黃的混合液）、蛋清、蛋黃中獸藥殘留分析方法。

【前人研究進展】早期畜禽樣品中磺胺二甲基嘧啶的提取和凈化方法較為復(fù)雜。安勝英等［4］采用C18填料與雞蛋樣品研磨，將其裝填至含有無水硫酸鈉的小柱，先用正己烷洗脫，除去脂肪等非極性化合物，再用二氯甲烷洗脫目標(biāo)化合物。近年來，固相萃取法是畜禽樣品中磺胺二甲基嘧啶的常用凈化方法。李宏娟等［5］采用乙酸乙酯提取和0.1 mol/L鹽酸溶劑轉(zhuǎn)換，再用正己烷除脂，然后用MCX柱凈化；ZHAO等［6］采用固相萃取柱（填料為多層碳納米管）對豬肉、雞肉和雞蛋樣品中磺胺二甲基嘧啶進行凈化處理；HOU等［7］采用類似方法處理豬肉樣品。雖然固相萃取法能極大程度地降低樣品中基質(zhì)干擾效應(yīng)，但是該方法較為耗時。以上方法均不適用于大批量樣品的快速檢測。盡管有文獻采用C18分散劑快速實現(xiàn)水產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶的凈化［8］，以及采用QuEChERS快速實現(xiàn)牛奶中磺胺二甲基嘧啶的凈化［9］，但二者的耗材相對較為昂貴；也有文獻報道了酶聯(lián)免疫法快速檢測肉和蛋中磺胺二甲基嘧啶的方法［3,10］，但是酶聯(lián)免疫法可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果而只適用于初步篩查［11-12］。【本研究切入點】液相色譜-紫外/熒光法是畜禽產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶的常用檢測方法，但是檢測限較高［13-15］，不適用于雞蛋中磺胺二甲基嘧啶（禁用藥物）的分析；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的靈敏度相對較高［16-17］，可以用于禁用藥物的分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用液液萃取建立蛋液、蛋黃和蛋清中磺胺二甲基嘧啶的快速前處理方法；同時利用高靈敏度和高選擇性的高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCESI-MS/MS）對樣品中磺胺二甲基嘧啶進行檢測，以期建立一種磺胺二甲基嘧啶的快速、綠色經(jīng)濟、靈敏的檢測方法，為大批量雞蛋中禁用藥物——磺胺二甲基嘧啶的檢測提供一種可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲醇（色譜純，德國默克公司），乙腈和正己烷（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；尼龍66濾膜（天津津騰公司），塑料離心管（美國Corning CentriStar公司），渦旋儀（美國Labnet公司），5804R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（8040 HPLC-MS/MS，日本島津公司），ACE UltraCore 2.5 SuperC18反相色譜柱（100×2.1 mm id，英國ACE公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與制備 雞蛋樣品于2017年7月采自廣州市不同的農(nóng)貿(mào)市場和超市，同時記錄樣品的產(chǎn)地、供貨商等信息。對雞蛋分離出蛋黃和蛋清；蛋液、蛋黃、蛋清樣品均采用勻漿機勻漿后置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品前處理 蛋液、蛋黃、蛋清樣品恢復(fù)至室溫后，稱取1.0 g置于50 mL塑料離心管。加入500 μL水稀釋樣品；加入8 mL乙腈，渦旋30 s，超聲10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液于15 mL塑料離心管。上清液水浴（40 ℃）中氮吹至0.5 mL，加入乙腈-0.1%甲酸水溶液（1∶9，V/V）至2 mL，渦旋30 s，10 000 r/min離心10 min。蛋清樣品，取1 mL上清液過濾膜，經(jīng)HPLC-MS/MS檢測磺胺二甲基嘧啶的濃度；蛋黃和蛋液樣品，取1.5 mL上清液于2.0 mL塑料離心管，加入正己烷（300 μL），渦旋30s，10 000 r/min離心5 min，取下層水相過濾膜，經(jīng)HPLC-MS/MS檢測磺胺二甲基嘧啶的濃度。

1.2.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備 取空白的蛋液、蛋黃、蛋清樣品，按照1.2.2步驟操作，得到空白基質(zhì)溶液。取空白蛋液、蛋黃、蛋清基質(zhì)溶液適量，加入適量磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，采用逐漸稀釋法分別配制蛋液、蛋黃和蛋清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL），以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為橫坐標(biāo)、濃度水平為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 儀器分析 基于本課題組建立的HPLC-MS/MS測定氟喹諾酮類藥物方法［18］，建立HPLCMS/MS測定磺胺二甲基嘧啶方法。ACE UltraCore 2.5 SuperC18反相色譜柱（100×2.1 mm id，英國ACE公司），柱溫40 ℃，進樣量為10 μL，流動相組成為0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），流速為0.3 mL/min，流動相梯度如表1所示。質(zhì)譜分析采用正離子電噴霧離子源（ESI）和多重離子裂解監(jiān)測模式（MRM），離子化電壓為4 500 V，去溶劑化和加熱板溫度分別為250 ℃和400 ℃，霧化氣和干燥氣流量分別為3 mL/min和15 mL/min?；前范谆奏さ亩ㄐ院投侩x子對分別為m/z 279.15→186.05和m/z 279.15→92.05。

1.2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度考察 在空白蛋液、蛋黃和蛋清中分別添加低、中、高3個不同濃度的磺胺二甲基嘧啶進行加標(biāo)回收試驗，各濃度3個平行實驗，3次重復(fù)，求平均回收率及批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表1 磺胺二甲基嘧啶色譜分離的流動相梯度Table 1 Gradient mobile phases for the chromatographic separation of sulfamethazine

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

蛋液、蛋清、蛋黃中磺胺二甲基嘧啶的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示?；前范谆奏ぴ谙鄳?yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)平方值R2＞999。根據(jù)待測物信噪比（S/N）≥3為方法檢測限，S/N≥10為方法定量限的原則，測得磺胺二甲基嘧啶在蛋液、蛋黃和蛋液中的方法檢測限為0.5 ng/g，方法定量限為1.0 ng/g。

2.2 回收率與重現(xiàn)性

本研究采用蛋液、蛋黃和蛋清進行基質(zhì)加標(biāo)回收試驗，表2列出了磺胺二甲基嘧啶在3種基質(zhì)中不同添加水平的平均回收率。蛋液、蛋黃和蛋清中磺胺二甲基嘧啶的平均回收率分別為 78.4%～85.2%、77.9%～89.0%、83.0%～88.1%，批內(nèi)變異系數(shù)分別為3.7%～5.9%、2.8%～5.3%、2.9%～11.5%，批間變異系數(shù)分別為4.0%～9.7%、4.8%～9.2%、5.4%～13.8%，表明本研究建立的分析方法穩(wěn)定可靠。

將本方法與文獻報道的生物樣品中磺胺二甲基嘧啶分析方法進行比較（表3）可知，本方法具有良好的加標(biāo)回收率和較低的方法檢測限，能滿足實際樣品測定的要求。

2.3 實際樣品分析

將本研究方法應(yīng)用于廣州市15例雞蛋樣品中磺胺二甲基嘧啶的分析，僅1例雞蛋樣品檢測到磺胺二甲基嘧啶，蛋液、蛋黃、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的含量分別為0.66、0.94、0.47 ng/g。圖2是蛋液、蛋黃、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的典型色譜圖。

3 討論

圖1 磺胺二甲基嘧啶的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合結(jié)果Fig.1 Matrix matching standard curve fitting of sulfamethazine

圖2 蛋液、蛋黃、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of sulfamethazine in whole eggs, yolks, and albumens

3.1 提取方法的優(yōu)化

雞蛋樣品，尤其是蛋清樣品，蛋白質(zhì)含量相對較高，在提取時直接加入提取劑（乙腈）后，樣品迅速結(jié)塊，易包裹目標(biāo)化合物，致使回收率降低且重復(fù)性不好。為了解決該問題，本研究在加入提取劑之前，加入0.5 mL水稀釋樣品，且在輕微震蕩狀態(tài)下加入提取劑，然后馬上渦旋，能有效避免樣品結(jié)塊的現(xiàn)象。本研究考察了提取溶劑的體積和提取次數(shù)對提取效率的影響。結(jié)果顯示，8 mL提取體積與10 mL提取體積的回收率（85%～89% vs 86%～89%）相當(dāng)，均高于5 mL提取體積（71%～73%）；相同提取體積條件下，一次提取與二次提取的回收率類似，但是二次提取時在后期正己烷除脂時存在乳化現(xiàn)象。因此，本研究將提取劑的體積設(shè)定為8 mL，提取次數(shù)設(shè)定為1次。

表2 蛋液、蛋黃、蛋清中添加不同濃度磺胺二甲基嘧啶的回收率Table 2 Recoveries of sulfamethazine with various addition concentrations in whole eggs, yolks, and albumens

表3 本研究方法與已報道的磺胺二甲基嘧啶分析方法的檢測限與加標(biāo)回收率比較Table 3 Comparison of detection limit and recovery between this method and the reported sulfamethazine detection method

3.2 凈化方法的優(yōu)化

大多數(shù)研究采用固相萃取小柱來凈化樣品［5-7］，較為耗時，不適合大批量樣品的分析。本研究根據(jù)磺胺二甲基嘧啶難溶于非極性溶劑正己烷，利用正己烷除去蛋液和蛋黃中脂肪等非極性雜質(zhì)。凈化方法較為簡潔，適合大批量樣品的分析。蛋清的脂肪含量極低，不需要凈化，可直接進行儀器分析。

3.3 儀器方法的建立

雞蛋中磺胺二甲基嘧啶的含量采用HPLCMS/MS檢測。首先對磺胺二甲基嘧啶化合物進行全掃描（Full scan, m/z 50～500），確定目標(biāo)化合物的特征離子；然后將特征離子作為母離子，進行子離子掃描，確定該目標(biāo)化合物的定性和定量離子對；最后，通過MRM模式，對化合物的碰撞能等參數(shù)逐一優(yōu)化，使其達到最優(yōu)。最終確定磺胺二甲基嘧啶的定性和定量離子對分別為m/z 279.15→186.05和m/z 279.15→92.05，碰撞能分別為-16 V和-30 V。

4 結(jié)論

蛋黃與蛋清的基質(zhì)不同，導(dǎo)致二者的前處理方法存在差異性。蛋黃的脂肪含量相對較高，需要采取除脂步驟；而蛋清的蛋白質(zhì)含量相對較高，在提取過程中需加水稀釋以防止蛋白質(zhì)結(jié)塊包裹目標(biāo)化合物。本研究采用乙腈溶劑提取、正己烷溶劑除脂的手段，建立雞蛋的蛋液、蛋黃和蛋清樣品的快速前處理方法，同時采用靈敏度高和選擇性好的HPLC-MS/MS分析樣品中磺胺二甲基嘧啶的含量。本研究的樣品前處理方法不需要過柱，操作簡潔、耗材低廉、方法靈敏度高，且方法具有良好的加標(biāo)回收率和較好的重現(xiàn)性，適合大批量蛋液、蛋黃與蛋清樣品中磺胺二甲基嘧啶的快速檢測。