黎小鵬 梁雪琪 陳楠 鄧桂添 馬世柱 周嘉誠 梁錦填

摘要 [目的]使用QuEChERS-EMR-Lipid前處理，超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀建立動物源性食品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法。[方法]優(yōu)化后的前處理條件：以乙腈作為萃取溶劑，搖勻后，旋渦振蕩1 min，以10 000 r/min常溫離心3 min，取5 mL上清液倒入已活化好的EMR-Lipid dSPE增強型脂質去除凈化管并放入陶瓷顆粒，劇烈振蕩3 min，以10 000 r/min常溫離心3 min;上清液全部轉移至EMR-Lipid Polish反萃取管中加入陶瓷顆粒并立即劇烈振蕩，超聲至管內(nèi)粉末全部溶解，以10 000 r/min常溫離心3 min，吸200 μL到樣品瓶中用超純水定容到1 mL，旋渦振蕩后上機檢測。色譜條件：色譜柱為Poroshell 120? EC-C18，流動相為甲醇-水，在4.6 min內(nèi)4種組分分離良好。質譜條件：噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）;負離子模式同時掃描;多反應監(jiān)測（MRM）采集方式。[結果]氟蟲腈及其代謝物在0.1～20.0 ng/g均具有良好的線性關系，相關系數(shù)≥0.999，平均加標回收率為94.9%～113.0%，相對標準偏差為1.9%～4.9%，方法檢出限為0.010～0.023 ng/g。[結論]超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀適用于動物源性食物中氟蟲腈及其代謝物的快速檢測。

關鍵詞 QuEChERS-EMR;氟蟲腈及其代謝物;動物源性食物;超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀

中圖分類號 TS207.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0204-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.060

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]A method for the determination of fipronil and its metabolites in animalderived foods was established using QuEChERSEMRLipid pretreatment and ultra performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry.[Method]Optimized preprocessing conditions：acetonitrile as an extraction solvent， whirlpool concussion， centrifugal， adding supernatant into activated EMRLipid dSPE enhanced lipid removal purification tube， whirlpool concussion， centrifugal again. dilute the supernatant. Chromatographic conditions： chromatographic column： Poroshell 120 ECC18， mobile phase is methanol water， and 4 components are well separated in 4.6 minutes. Mass spectrum conditions： jet flow electrospray ion source （AJS ESI）; negative ion mode simultaneous scanning; multi reaction monitoring （MRM） acquisition mode.[Result]The calibration curves for fipronil and its metabolites had good linear relationship in the range of 0.1 - 20.0 ng/g， with correlation coefficients not less than 0.999. The average spiked recoveries ranged from 94.9% to 113.0% with relative standard deviations of 1.9%-4.9%. The limits of detection were in the range of? 0.01-0.023 ng/g. [Conclusion]The method was applied in the determination for fipronil and its metabolites in animal derived foods with satisfactory results.

Key words QuEChERSEMRLipid;Fipronil and its metabolites; Foods of animal origin; Ultra high performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry（UHPLCQQQ）

作者簡介 黎小鵬（1965—），女，廣東中山人，高級農(nóng)藝師，從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測研究。

收稿日期 2019-01-22

氟蟲腈是由法國羅納-普朗克農(nóng)化公司在1987 年所開發(fā)研制的苯基吡唑類高活性殺蟲劑，化學名稱（RS）-5-氨基-（2.6-二氯-4a-三氟甲基苯基）-4-三氟甲基亞磺?；吝?3-腈基吡唑，銳勁特（Regent）是其商標的名稱，英文的通用名稱為 Fipronil。早期主要用于防治蔬菜、水稻、煙草、棉花、蓄牧業(yè)、公共衛(wèi)生、貯存用品及地面建筑中各類別的作物害蟲以及衛(wèi)生害蟲，殺蟲譜廣，活性高，且持效期長。但氟蟲腈對蜜蜂和水生生物高風險，在水和土壤中降解慢[1]，危害生態(tài)環(huán)境安全，我國于2009年10月1日起禁用，目前，氟蟲腈僅可用于衛(wèi)生和玉米等部分旱田種子包衣劑[2]。氟蟲腈被世界衛(wèi)生組織列為“對人類有中度毒性”的化學品[3]，且其代謝物具有更高的毒性[4]，大量進食含有高濃度氟蟲腈的食品，會損害肝臟、甲狀腺和腎臟[5]。國際食品法典（CAC）和日本食品安全標準中規(guī)定，氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量為0.02 mg/kg;美國相關標準規(guī)定，氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量為0.03 mg/kg;歐盟相關標準規(guī)定，氟蟲腈在食品中的最大殘留限量為0.005 mg/kg，且不得用于人類食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過程。美國環(huán)境保護局于2011年將氟蟲腈列為C級致癌物[5]。

2017年7月20日，比利時通過歐盟食品和飼料類快速預警系統(tǒng)（RASFF）通報雞蛋中檢出氟蟲腈，之后多個歐洲國家相繼檢出[6]。據(jù)報道，問題雞蛋產(chǎn)自荷蘭，氟蟲腈被不恰當?shù)赜糜陴B(yǎng)雞場的清潔物品中，造成雞蛋被檢出殘留物。此次污染事件因其使用的清潔用品非法添加了氟蟲腈。8月26日，臺灣農(nóng)業(yè)主管部門發(fā)布新聞稿，經(jīng)檢驗全臺蛋雞場氟蟲腈殘留超過定量極限標準的雞蛋不合格的有44個蛋雞場，逾100萬顆雞蛋回收封存或退回[7]。

我國國標中規(guī)定了多種種植業(yè)產(chǎn)品中氟蟲腈的最大殘留限量[8]，但未對任何動物源性食品做出規(guī)定。2016年11月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布《關于公開征求對食品中農(nóng)藥最大殘留限量國家標準的意見的函》，該函中有2個附件，其中附件2中補充規(guī)定了氟蟲腈在牛肉、脂肪、牛腎、牛肝、家禽肉類、家禽可食用內(nèi)臟、蛋類及牛奶中的要求，但附件中規(guī)定的2個檢測標準中均沒有氟蟲腈及其代謝物項目。在已發(fā)表的文獻中[9-13]，對于動物源性食品中的氟蟲腈及其代謝物前處理凈化方法，常用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe，意為快速、容易、便宜、有效、簡單和安全）或固相萃?。⊿PE）。該研究探討使用對脂肪去除能力更佳的QuEChERS-EMR前處理方法，經(jīng)過3次渦旋振蕩離心，即可定容待測，使用超高液相色譜-三重四極桿質譜儀（LC-QQQ）同時測定動物源性食品中氟蟲腈及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀UHPLC-QQQ 1290-6495，美國安捷倫公司;渦旋混合器XW-80A，上海精科實業(yè)有限公司;電子天平OHAUS-CP2102，奧豪斯儀器有限公司;3-30k高速冷凍離心機，SIGMA公司;超聲波清洗機KQ-500E，昆山超聲波儀器有限公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈均為色譜純，德國Merck公司生產(chǎn);EMR-Lipid dSPE增強型脂質去除凈化管（PN：5982-1010），EMR-Lipid Polish反萃取管（PN：5982-0101），陶瓷均質子（PN：5982-9312），均為美國安捷倫公司生產(chǎn)。

氟蟲腈及其代謝物：氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚，濃度1 000 μg/mL，所有標準品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所（天津）。混合后配成濃度為100 μg/mL混合標準溶液，經(jīng)逐級稀釋，上機前用空白基質將4種農(nóng)藥混標配制成校正曲線工作液，其濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L。

1.3 儀器條件

1.3.1

色譜條件。色譜柱為Poroshell 120? EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）;柱溫45 ℃;流速0.4 mL/min;進樣量5 μL;流動相：水-甲醇，梯度洗脫，詳見表1。

1.3.2 質譜條件。噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）;負離子模式同時掃描;多反應監(jiān)測（MRM）采集方式;ifunnel高壓120 V、低壓90 V;干燥氣溫度200 ℃;干燥氣流量14.0 L/min;霧化氣壓力241.3 kPa;鞘氣溫度350 ℃;鞘氣流量10.0 L/min;毛細管電壓3 kV;噴嘴電壓1 500 V;MS及MS均為單位分辨率;碰撞能380 V;離子加速電壓4 V;4種化合物的質譜采集參數(shù)見表2。

1.4 樣品前處理

稱取5 g（精確到0.01 g）的雞蛋、雞肉或牛奶樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈快速搖勻后，旋渦振蕩1 min，以10 000 r/min冷凍離心3 min;等待離心時對EMR-Lipid dSPE增強型脂質去除凈化管進行預處理，加入5 mL水并立即旋渦混合，備用;離心結束后吸取5 mL上清液到上述已活化好的EMR-Lipid dSPE增強型脂質去除凈化管并放入2個陶瓷均質子，劇烈振蕩1 min，旋渦混合2 min，以10 000 r/min常溫離心3 min;上清液全部轉移至EMR-Lipid? Polish反萃取管中加入2個陶瓷均質子，蓋緊蓋子并立即劇烈振蕩，超聲至粉末全部溶解，以10 000 r/min常溫離心3 min，吸200 μL上清液到樣品瓶中并加入800 μL超純水，旋渦振蕩后上機檢測。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化

液相連接兩通，0.1 mg/L單標溶液進樣5 μL，采用負離子掃描模式對相應模式的母離子進行掃描，待測物母離子均為[M-H]-，以準分子離子為母離子進行二級質譜掃描，得到各個化合物相應響應值最佳的碎片離子。

利用分子量計算器計算單同位素質量數(shù)，獲得氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜4個化合物的單同位素質量數(shù)分別為435.94、387.97、451.93和419.94。在MS Tune模式下，用單同位素質量數(shù)開展手動調(diào)諧方法研究。在電噴霧正離子電離（ESI +）模式下，4個化合物均無響應;在電噴霧負離子電離（ESI-）模式下，均有響應值高的分子離子峰[M-H]-，該試驗采用負離子模式掃描，MRM參數(shù)詳見表2。

2.2 流動相及色譜條件優(yōu)化

該試驗在相同梯度洗脫程序等液相條件下，比較不同有機溶劑（甲醇、乙腈作為流動相）的色譜分離效果，結果發(fā)現(xiàn)（圖1～2），使用甲醇作為流動相時4種化合物有效分離;使用乙腈作為流動相時，氟蟲腈砜與氟蟲腈硫醚不能有效分離。所以該試驗采用甲醇作為流動相。

2.3 前處理凈化方法的選擇

分別比較QuEChERS-EMR、QuEChERS、固相萃取（SPE）3種前處理凈化方法，在樣品中加入2 ng/g的氟蟲腈及其代謝物混合標準品，計算3種前處理方法下的回收率。

2.3.1 QuEChERS-EMR凈化。按“1.4”處理。

2.3.2 QuEChERS凈化。按“1.4”前部分提取，第1次離心后吸取5 mL上清液至分散固相萃取試劑盒（15 mL離心管，含50 mg乙二胺-N丙基硅烷 PSA、150 mg C18 EC、900 mg硫酸鎂，PN：5982-4950）中，放入2個陶瓷均質子，劇烈振蕩1 min，旋渦混合2 min，以10 000 r/min常溫離心3 min，取200 μL上清液到樣品瓶中并加入800 μL超純水，旋渦振蕩后上機檢測。

2.3.3 SPE凈化。按“1.4”前部分提取，第1次離心后吸取2 mL上清液至玻璃試管中，50 ℃氮吹至近干，加入2 mL正己烷待凈化;依次用5 mL V（丙酮）∶V（正己烷）=1∶9、5 mL正己烷預淋洗弗羅里矽SPE小柱（1 g，6 mL），小柱條件化后，加入上述2 mL提取物正己烷溶液，用5 mL V（丙酮）∶V（正己烷）=1∶9沖洗試管后洗脫弗羅里矽柱，重復1次，收集洗脫液，氮吹至近干，加入1 mL正己烷，渦旋混合，取200 μL到樣品瓶中并加入800 μL超純水，旋渦振蕩后上機檢測。

結果發(fā)現(xiàn)，3種凈化方法的加標回收率無顯著差異，詳見表3;但使用質譜進行全掃描，其凈化效果見圖3，從圖中可看出，QuEChERS-EMR的雜質峰更少，因EMR凈化管對脂肪吸附能力更強，對動物源性樣品的潔凈效果更明顯，則儀器清潔維護的成本可大大減少;從操作簡易程度看，QuEChERS最快捷，但凈化效果不夠理想，SPE的凈化效果與QuEChERS-EMR相當，但操作復雜，需時更長，10個樣本約3 h完成凈化處理，該試驗選擇QuEChERS-EMR作為凈化方法。

2.4 定量方法的線性檢測范圍

以混合標準溶液的濃度為橫坐標、各目標化合物色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，其線性關系相關系數(shù)、回歸方程見表4。氟蟲腈及其代謝物在0.1～20.0 ng/mL線性關系良好，r值均大于0.999。

2.5 方法檢出限

最低檢出限按最低濃度點1.0 ng/g的響應值與基線的噪聲響應的3倍計算，檢出限結果見表4。氟蟲腈及其代謝物的方法檢出限為0.010～0.023 ng/g，能滿足動物源性食物中微量氟蟲腈及其代謝物的檢測。

2.6 方法回收率和精密度

在相同的試驗條件下，分別對6個空白禽肉、禽蛋樣品添加濃度為2.0、10.0、20.0 ng/g的氟蟲腈及其代謝物混合標樣，進行加標回收和精密度測試，測試結果見表4。氟蟲腈及其代謝物的加標回收率為94.9%～113.0%，相對標準偏差為1.9%～4.9%，可見該方法具有很好的回收率和精密度。

3 結論

該試驗采用QuEChERS-EMR前處理，提取效率高，操作簡便快捷，且有機溶劑用量少，對環(huán)境友好;使用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用技術，建立了動物源性食物中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法，整個分析過程簡單快捷，大大減少人為誤差，檢測方法的準確性好、精密度高，適合于動物源性食物中氟蟲腈及其代謝物的快速檢測。

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