徐新蕊　單文靜　吳健

[摘要] 目的 建立超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定烏頭湯中8種成分的定量方法。 方法 選用Waters Acquilty UPLC C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相。質(zhì)譜條件：電噴霧離子（ESI）源，采用多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）對(duì)烏頭湯中苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿進(jìn)行定量分析。 結(jié)果 苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿等8種成分的線(xiàn)性范圍分別為0.014～0.229、0.384～0.003、0.007～0.922、1.072～137.321、0.055～7.084、0.148～18.974、0.204～26.226、0.038～4.951 μg/mL，r2>0.9990，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.31%、1.52%、1.42%、1.56%、1.47%、1.59%、1.61%、1.57%。重復(fù)性RSD分別為2.4%、2.6%、2.7%、2.5%、3.1%、3.5%、2.3%、3.4%?；厥章室来螢?2.68%、91.99%、92.79%、96.71%、97.19%、96.79%、98.15%、96.09%，RSD<2.15%。 結(jié)論 該方法快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定烏頭湯中的8種成分以及烏頭湯的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 烏頭湯；超高效液相色譜；三重四極桿質(zhì)譜；多反應(yīng)檢測(cè)模式；質(zhì)量控制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）01（c）-0147-05

[Abstract] Objective To establish a quantitative method of simultaneous determination of 8 major components in Wutou Decoction by ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry. Methods Waters Acquilty UPLC C18 column （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was selected as chromatographic column， aqueous solution of acetonitrile-1% acetic acid was taken as mobile phase. The conditions of mass spectrum： electrospray ions （ESI） source， multiple reaction monitoring （MRM） was used to take quantitative analysis of benzoylaconitine， benzoylhypaconitine， benzoylmesaconine， paeoniflorin， calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， liquiritin， ammonium glycyrrhetate， ephedrine in Wutou Decoction. Results The linearity range of 8 major components of benzoylaconitine， benzoylhypaconitine， benzoylmesaconine， paeoniflorin， calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， liquiritin， ammonium glycyrrhetate， ephedrine was 0.014-0.229， 0.384-0.003， 0.007-0.922， 1.072-137.321， 0.055-7.084， 0.148-18.974， 0.204-26.226， 0.038-4.951 μg/mL respectively， r2>0.9990. The relative standard deviation （RSD） of precision was 1.31%， 1.52%， 1.42%， 1.56%， 1.47%， 1.59%， 1.61%， 1.57% respectively. The repeatability of RSD was 2.4%， 2.6%， 2.7%， 2.5%， 3.1%， 3.5%， 2.3%， 3.4% respectively. The recovery rate was 92.68%， 91.99%， 92.79%， 96.71%， 97.19%， 96.79%， 98.15%， 96.09% respectively， RSD<2.15%. Conclusion This method is rapid， simple and convenient， with good repeatability， which can be used for the simultaneous determination of 8 major components in Wutou Decoction and the quality control of Wutou Decoction.

[Key words] Wutou Decoction； Ultra-high performance liquid chromatography； Triple quadrupole mass spectrometry； Multiple reaction monitoring； Quality control

烏頭湯出自《金匱要略》，由制川烏、麻黃、炙甘草、白芍、黃芪組成，具有溫經(jīng)散寒、祛濕鎮(zhèn)痛的功效，主治寒濕痹證[1-3]。制川烏雖是有毒之品，在臨床上卻廣泛應(yīng)用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、麻醉鎮(zhèn)痛等[4-6]。國(guó)內(nèi)外就烏頭湯中有效成分的測(cè)定及其在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的客觀(guān)內(nèi)在規(guī)律中進(jìn)行了多層次的研究，并取得了一定的進(jìn)展[7-20]，但鮮見(jiàn)關(guān)于烏頭湯方劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜法對(duì)烏頭湯中8種有效成分同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀，Agilent 6460質(zhì)譜檢測(cè)器；BandelinSonorex RK 1208BH超聲波清洗器（德國(guó)）；HWS 24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Milipore超純水機(jī)；美國(guó)Mililpore公司METTLER Toledo AB265-S電子天平（瑞士）。

1.2 藥品

甲醇、乙腈購(gòu)于美國(guó)ACS恩科化學(xué)，乙酸、乙酸銨購(gòu)于Sigma公司，均為色譜純。水為超純水，其余試劑均為分析純。制川烏、麻黃、白芍、黃芪、炙甘草等藥材購(gòu)于哈爾濱人民同泰藥房，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)理學(xué)院吳健副研究員鑒定均為正品。芍藥苷、甘草酸銨、甘草苷、麻黃堿、苯甲酰烏頭原堿（BA）、苯甲酰次烏頭原堿（BHA）、苯甲酰新烏頭原堿（BMA）、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu苷購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters ACQULTY UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行分析，以0.01 mol/L醋酸銨溶液（含0.1%乙酸溶液）為流動(dòng)相A，乙腈為B，進(jìn)行梯度洗脫。0～20 min，流動(dòng)相A（%）為95→80；20～30 min，流動(dòng)相A（%）為80→70；30～40 min，流動(dòng)相A（%）為70→50；40～50 min，流動(dòng)相A（%）為50，流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，柱溫為30℃。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI源），檢測(cè)方式：正離子檢測(cè)，掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），對(duì)照品的選擇檢測(cè)離子質(zhì)荷比為芍藥苷：498.2→179.1；甘草酸銨：823.4→453.3；甘草苷：419.1→257.1；麻黃堿：166.0→132.8；BA：604.3→105.1；BHA：574.3→105.1；BMA：590.3→105.1；毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu：447.1→285.1，干燥氣（N2）流速11.0 L/min，Nebulizer 0.10335 MPa，干燥氣溫度300℃，檢測(cè)器電壓4000 V。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密取各對(duì)照品適量，分別置于量瓶中以甲醇溶解并定容，搖勻，得對(duì)照品溶液，精密吸取各對(duì)照品溶液于同一容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液。各成分含量為芍藥苷137 μg/mL、甘草酸銨26.2 μg/mL、甘草苷18.9 μg/mL、麻黃堿4.96 μg/mL、BA 0.229 μg/mL、BHA 0.384 μg/mL、BMA 0.926 μg/mL、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu 7.08 μg/mL。

2.4 供試品溶液的制備

按照《金匱要略》記載的烏頭湯方劑配藥：稱(chēng)取川烏6 g、黃芪9 g、麻黃9 g、甘草9 g、白芍9 g粉末，混合后以10倍量水浸泡1 h，回流提取1.5 h，取上清液，將藥渣再以8倍量水提取1.5 h，合并上清液。濃縮水煎液并減壓干燥，得浸膏12.1 g。取浸膏約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲處理30 min，補(bǔ)重，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 陰性對(duì)照溶液的制備

按照“2.3”項(xiàng)下方法制成不含上述8種標(biāo)準(zhǔn)品的陰性樣品溶液，備用。

2.6 專(zhuān)屬性考察

按色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果樣品在各對(duì)照品的位置上無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

2.7 線(xiàn)性關(guān)系的考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，依次稀釋得系列質(zhì)量濃度溶液。在上述色譜條件下測(cè)定，峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 精密度考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組色譜峰峰面積。結(jié)果BA、BHA、BMA、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.23%、1.41%、1.37%、1.38%、1.31%、1.42%、1.39%、1.26%。精密吸取混合對(duì)照品溶液連續(xù)2 d進(jìn)樣，每天3次，記錄各組色譜峰峰面積。8種對(duì)照品峰面積的RSD分別為1.31%、1.52%、1.42%、1.56%、1.47%、1.59%、1.61%、1.57%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品6份，按“2.4”項(xiàng)下配制供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。結(jié)果BA、BHA、BMA、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿峰面積的RSD分別為2.4%、2.6%、2.7%、2.5%、3.1%、3.5%、2.3%、3.4%（n = 6）符合試驗(yàn)要求。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品，按“2.4”項(xiàng)下制備溶液，放置于進(jìn)樣室中，放置0、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)。結(jié)果BA、BHA、BMA、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿峰面積的RSD分別為3.3%、2.1%、2.7%、3.2%、3.0%、2.7%、2.9%、2.5%（n = 6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)定樣品約0.5 g，加入各對(duì)照品溶液適量，按“2.4”項(xiàng)下制備，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法的要求。

2.12 樣品含量測(cè)定

按照“2.4”項(xiàng)下方法制備三批烏頭湯浸膏，“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)，計(jì)算每批樣品中各檢測(cè)成分的含量。見(jiàn)表3。

3 討論

本試驗(yàn)考察了不同色譜柱、流動(dòng)相及質(zhì)譜條件對(duì)化合物定量的影響，結(jié)果表明，Waters Acquilty UPLC C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，效果較為理想，各化合物峰形良好。使用乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相，各化合物分離較好，無(wú)相互干擾，出峰時(shí)間短。

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（收稿日期：2016-10-09 本文編輯：張瑜杰）