趙玉嬌+徐文慧+沈小麗+田俊生+秦雪梅

[摘要]建立白術(shù)的薄層鑒別與其中3種內(nèi)酯類成分含量同時測定方法。使用硅膠GF₂₅₄薄層板對白術(shù)進行定性鑒別；利用UPLC-PDA梯度洗脫法同時測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，選用Waters BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-水，檢測波長235 nm。薄層鑒別特征明顯，專屬性強；含量測定的方法學考察結(jié)果符合規(guī)定，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ， Ⅱ，Ⅲ線性關(guān)系良好（r>0.999 9），平均回收率分別為93.48%（RSD 1.4%）， 94.97%（RSD 1.6%）， 92.71%（RSD 1.2%）。所建立的白術(shù)薄層鑒別方法專屬性強、重復性好，3種內(nèi)酯類成分同時測定方法操作簡單、靈敏度高，兩者結(jié)合可以更好的用于白術(shù)的質(zhì)量評價。

[關(guān)鍵詞]白術(shù)； 白術(shù)內(nèi)酯； 薄層鑒別； 超高效液相色譜； 質(zhì)量評價

[Abstract]This research is to establish TLC and UPLC methods for simultaneous determination of 3 atractylenolides in Atractylodes macrocephala. Silica gel GF₂₅₄ plate was used for identification of A. macrocephala， and UPLC-PDA gradient elution method was used to simultaneously determine atractylenolide Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. The Waters BEH C₁₈ column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with acetonitrile-water as mobile phase and the wavelength of UV detector of 235 nm were performed. The quality control study showed that the characteristic for identification by TLC was distinct and highly specific. The method of content determination was in accordance with the regulations. The quantitative evaluation of atractylenolide Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ was in good linear range（r>0.999 9）， and the average recovery was 93.48%（RSD 1.4%），94.97%（RSD 1.6%），92.71%（RSD 1.2%），respectively. TLC identification was in good specificity and repeatability， and the UPLC-PDA method for the simultaneous determination of 3 atractylenolides was simple and reliable for the quality control of A.macrocephala.

[Key words]Atractylodes macrocephala； atractylenolide； TLC； UPLC； quality control

白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的根莖，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲、眩悸、水腫、自汗、胎動不安等癥^[1]。主要化學成分為揮發(fā)油，如

蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇等；內(nèi)酯類成分，如白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、雙白術(shù)內(nèi)酯等^[2-4]。2015年版《中國藥典》（一部）白術(shù)的質(zhì)量標準^[5]中，TLC鑒別僅以蒼術(shù)酮為指標成分，尚無含量測定項。而蒼術(shù)酮是我國傳統(tǒng)中藥白術(shù)及蒼術(shù)（Rhizoma Atractylodis）等蒼術(shù)屬藥用植物揮發(fā)油的主要活性成分^[6]，僅用蒼術(shù)酮作為白術(shù)的鑒別指標不具有專屬性。此外，白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ也為白術(shù)的主要活性成分^[7]，但相對蒼術(shù)酮來說含量較低，藥典中只用含量較高的蒼術(shù)酮作為質(zhì)量控制指標，不能全面反映白術(shù)的質(zhì)量，因此增加除蒼術(shù)酮以外的白術(shù)內(nèi)酯類成分的TLC鑒別及建立相應的含量測定方法，對于提升白術(shù)及含白術(shù)的成方制劑的質(zhì)量控制具有重要意義和價值。

關(guān)于白術(shù)的薄層鑒別，除蒼術(shù)酮之外未見有其他成分的研究，本實驗參考其他有關(guān)內(nèi)酯類成分的鑒別研究^[8-9]，根據(jù)該類成分的理化性質(zhì)，增加了以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ為指標成分并結(jié)合蒼術(shù)酮的薄層鑒別方法，該方法專屬性強，效果較好。關(guān)于白術(shù)的含量測定方面，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ以及蒼術(shù)酮多見，研究多采用GC測定蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇等揮發(fā)性成分的含量^[10-11]，以HPLC測定白術(shù)中內(nèi)酯類成分^[12]，未見有用UPLC在同波長下同時測定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的分析方法^[13-14]。本文基于UPLC-PDA建立了同時測定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的分析方法，相對于HPLC具有檢測靈敏度較好，分析周期短、進樣量少和成本節(jié)約等特點，為建立全面可控的白術(shù)質(zhì)量評價方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司，配備Acquity UPLC QSM、Acquity UPLC Sample Manager FTN、Acquity UPLC PDA Detector以及Empower工作站）；CPA 225D型1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）；BSA 124S型1/1萬電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q純水機（Direct 8/16 系統(tǒng)，美國Millipore公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品（純度98%，批號YJ-A3-1160519 ），白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌罚兌?8%，批號YJ-A3-1160519 ），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（純度98.5%，批號YJ-C1-WG1160520 ），蒼術(shù)酮對照品（純度99%，批號YJ-C1-WG1160520），均購自上海永恒生物科技有限公司，硅膠GF₂₅₄薄層板購自青島海洋化工廠。甲醇、磷酸、甲酸、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

白術(shù)樣本隨機購自10家不同的藥房，包括10批生白術(shù)和10批炒白術(shù)（樣本來源見表1），經(jīng)山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為正品，留樣于本中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別實驗方法與結(jié)果

2.1.1 對照品溶液的制備

分別取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品約10 mg，精密稱定，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1.186，1.270，1.161 g·L^-1的對照品溶液，作為母液；分別精密吸取各母液0.5，0.5，1 mL各定容至10 mL，得59.3，63.5，116.1 mg·L^-1的對照品溶液，備用。取蒼術(shù)酮對照品約5 mg，精密稱定，加甲醇溶解，配制成0.577 g·L^-1的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取過3號篩（80目）的白術(shù)粉末0.5 g，加甲醇定容至5 mL量瓶中，稱重，超聲提取50 min，冷卻至室溫，加甲醇補足失重，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 薄層鑒別

照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部，通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF₂₅₄薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸香草醛硫酸溶液，于100 ℃下加熱至斑點清晰，在254 nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品色譜相應的位置上顯相同顏色熒光斑點，在與蒼術(shù)酮對照品色譜相應的位置上顯相同暗紅色斑點。

按照以上鑒別方法，對10批生白術(shù)和10批炒白術(shù)樣品進行了薄層鑒別試驗，其結(jié)果見圖1。

2.2 含量測定實驗方法與結(jié)果

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密吸取2.1.1項下各對照品母液0.5，0.5，1 mL定容至10 mL，得59.3，63.5，116.1 mg·L^-1的混合儲備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取過3號篩（80目）的白術(shù)（BZ6）粉末約0.5 g，置10 mL量瓶中，精密稱定，加入甲醇定容，稱重，超聲50 min，冷卻至室溫，加甲醇補足失重，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗

色譜柱：Waters BEH C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫，0～3 min，10%～20% A，3～7 min，20%～45% A，7～10 min，45%～46% A，10～14 min，46%～48% A，14～17 min，48%～48% A，17～18 min，48%～50% A，18～20 min，50%～53% A，20～22 min，53%～53% A，22～27 min，53%～80%A，27～30 min，80%～88% A，30～33 min，88%～10% A；檢測波長：235 nm；進樣量：2 μL；流速：0.2 mL·min^-1；柱溫：30 ℃。對照品及樣品色譜圖，見圖2，各成分均達到基線分析，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的理論塔板數(shù)均大于1萬，分離度均大于1.5。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關(guān)系 將2.2.1項下混合儲備液逐級稀釋成系列濃度 （分別為原濃度的1，1/2，1/4，1/6，1/8），分別進樣。以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，回歸方程見表2。

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下白術(shù)供試品溶液，連續(xù)進樣6次，計算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 峰面積的 RSD 分別為 0.60%， 0.40%， 1.4%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.2.2項下白術(shù)供試品溶液，在 0～24 h內(nèi)，分別在0， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24 h進樣1次，計算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ 峰面積的RSD分別為 1.6%， 1.8%， 1.6%，表明供試品溶液中3種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4 重復性試驗 取同批白術(shù)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，進樣測定。計算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 峰面積的RSD分別為0.90%， 1.2%， 1.3%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.5 回收率試驗 精密稱取已知白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的同批白術(shù)樣品0.5 g，平行9份，各置10 mL量瓶中，平均分為3組，每組分別按白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的50%， 100%， 150% 精密加入質(zhì)量濃度為1.186， 1.270， 1.161 g·L^-1白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的母液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定。計算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的加樣回收率分別在90.48%～94.88%， 93.18%～96.79%， 90.96%～95.30%，平均回收率分別為 93.48%， 94.97%， 92.71%，RSD 分別為 1.4%， 1.6%， 1.2%，表明該方法準確度良好。

2.2.4.6 含量測定 取購置的10批生白術(shù)和10批炒白術(shù)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察

薄層鑒別實驗中考察了不同提取溶劑，包括正己烷和甲醇，發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果最佳。含量測定考察了甲醇、乙醇2種提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取3種白術(shù)內(nèi)酯的含量最高，故選定甲醇為提取溶劑。同時考察了超聲提取時間，最終確定提取方法為超聲提取50 min效果較好。因此薄層鑒別實驗和含量測定采用相同備樣方法，即甲醇超聲提取50 min。

3.2 薄層鑒別條件優(yōu)化

本實驗對比了石油醚（60～90 ℃）、環(huán)己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯等多種展開劑，分別考察了二相、三相和四相展開系統(tǒng)以及不同展開比例對白術(shù)中指標成分的分離效果，結(jié)果以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑進行薄層鑒別，各指標成分斑點清晰、分離效果最佳。分別考察了薄層板展開過程中溫度和相對濕度對結(jié)果的影響，結(jié)果表明：溫度為4，15，25，30 ℃時，各指標成分斑點的Rf在較小范圍內(nèi)波動，但對分離效果幾無影響；相對濕度為32%，52%，75%，83%時，各指標成分斑點的Rf變化極小，不影響分離效果。

3.3 色譜條件優(yōu)化

實驗中嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、乙腈-磷酸-水等流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用酸時白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品均發(fā)生分解，而采用乙腈-水系統(tǒng)時無分解現(xiàn)象，且白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的分離度及對稱性均良好，保留時間適中。本實驗中檢測波長的選擇是通過紫外200～400 nm 全掃描，在235 nm 處白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 3種物質(zhì)吸收較好，峰型適中，基線平穩(wěn)，故確定檢測波長為235 nm。

3.4 小結(jié)

文獻報道白術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)酮不穩(wěn)定，影響其不穩(wěn)定的主要條件為光照和溫度^[15-16]。蒼術(shù)酮在空氣中會氧化產(chǎn)生白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、表白術(shù)內(nèi)酯I 和雙白術(shù)內(nèi)酯等幾種物質(zhì)^[17-18]。本實驗過程中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，蒼術(shù)酮對照品溶液在放置一段時間后發(fā)生分解，在薄層色譜圖中可看到蒼術(shù)酮對照品分解為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ這2種物質(zhì)見圖1，而關(guān)于其轉(zhuǎn)化的機制有待進一步深入研究。

本實驗在國家藥典的基礎(chǔ)上增加了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的薄層鑒別方法，使鑒別內(nèi)容更加全面也更有專屬性；所建立的3種內(nèi)酯類成分同時測定的UPLC-PDA 方法，經(jīng)方法學驗證和20批樣品的測定，證明該法操作簡便、靈敏準確，更能客觀、準確的反映白術(shù)的質(zhì)量，有了較為明顯的改進。但本文所用樣本量相對較少，且所選2種不同炮制方法的白術(shù)不是同一批次，本實驗只是說明了所建方法的可行性，如果要對比不同炮制品之間的質(zhì)量差異，還應增加樣本量并使用同批生白術(shù)樣本，經(jīng)過炮制后再比較。

[參考文獻]

[1]李偉，文紅梅，崔小兵，等.白術(shù)的化學成分研究[J].中草藥，2007，38（10）：1460.

[2]陳建明，陳彬，陳建真，等.不同產(chǎn)地白術(shù)的化學成分研究進展[J].中醫(yī)藥學報，2010，38（5）：144.

[3]梁志遠，冉曉燕，周進康.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的化學研究進展[J].貴州師范學院學報，2013，29（9）：29.

[4]池玉梅，李偉，文紅梅，等.白術(shù)多糖的分離純化和化學結(jié)構(gòu)研究[J].中藥材，2001，24（9）：647.

[5]中國藥典.一部[S].2015：103.

[6]韓邦興，彭華勝，張玲.蒼術(shù)屬藥用植物揮發(fā)油成分的組分分析[J].食品與機械，2015，31（4）：5.

[7]何結(jié)煒，何明珍，胡子帆，等.白術(shù)區(qū)別蒼術(shù)的特征性成分的研究[J].江西中醫(yī)學院學報，2007，19（4）：50.

[8]邵艷華，王建剛，賴小平，等.穿心蓮二萜內(nèi)酯類成分的高效薄層色譜指紋圖譜研究[J].中藥材，2014，37（2）：219.

[9]徐韌柳.復方苦木消炎片薄層鑒別與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測定研究[J].中成藥，2004，26（12）：1003.

[10]李瀅，陶海燕，楊秀偉.生白術(shù)和炒白術(shù)揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].藥物分析，2013， 33（7）：1210.

[11]邱琴，崔兆杰，劉廷禮，等.白術(shù)揮發(fā)油化學成分GC-MS研究[J].中草藥，2002，33（11）：980.

[12]段啟，許冬謹，謝晨. HPLC法測定白術(shù)不同炮制品中白術(shù)內(nèi)酯[J].中草藥， 2008， 39（9）：1343.

[13]王知青，尹華，王玲，等.白術(shù)的質(zhì)量評價研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（4）：823.

[14]張程榮，曹崗，叢曉東，等.白術(shù)化學成分和質(zhì)量控制研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（10）：2328.

[15]郝延軍，桑育黎，李寶林，等.蒼術(shù)酮的常溫穩(wěn)定性研究中成藥[J].中成藥，2007，29（6）：895.

[16]李玲輝，竇德強.白術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)酮的穩(wěn)定性研究[J].世界科學技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（1）：193.

[17]李偉，文紅梅，崔小兵，等.白術(shù)的炮制機理及其倍半萜成分轉(zhuǎn)化的研究[J].中國中藥雜志，2006，31（19）：1600.

[18]王小芳，王芳，張亞環(huán)，等.白術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)酮氧化反應的動力學[J].應用化學，2007，24（3）：301.

[責任編輯 丁廣治]