陳巖勤 高秀麗 諸葛洪祥 楊世林 李笑然 楊盛剛

摘要 [目的]研究白頭翁皂苷經(jīng)腹腔注射給藥對血吸蟲病肝纖維化的作用機制。[方法]將30只C57BL/6雌性小鼠隨機分為陰性對照組、陽性對照組和白頭翁皂苷組，每組10只。血吸蟲感染40條尾蚴6周后，陰性對照組、陽性對照組腹腔注射0.9%生理鹽水，白頭翁皂苷組腹腔注射白頭翁皂苷注射液。感染8周后，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）及天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）含量;稱取小鼠體重及肝重;免疫組化觀察肝組織α-SMA表達。[結果]白頭翁皂苷組小鼠的體重、肝重、ALT及AST含量與陽性對照組比較均有統(tǒng)計學意義，白頭翁皂苷組肝臟α-SMA表達明顯低于陽性對照組。[結論]白頭翁皂苷經(jīng)腹腔注射給藥可明顯減輕日本血吸蟲病所引起的肝纖維化程度。

關鍵詞 白頭翁皂苷;肝纖維化;丙氨酸氨基轉移酶;天門冬氨酸氨基轉移酶;α-平滑肌肌動蛋白

中圖分類號 S567文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0181-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.053

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Abstract [Objective]The research aimed to study the effects of total saponins of pulsatilla against liver fibrosis in mice infected with Schistosoma japonicum. [Method]Thirty C57BL/6 female mice were randomly divided evenly into negative control group， positive control group and Pulsatilla saponin group. After positive control group and Pulsatilla saponin group infected with 40 S.japonicum cercariae for 6 weeks， the negative control group and the positive control group were intraperitoneally injected with 0.9% normal saline， and the Pulsatilla saponin group were intraperitoneally injected with Pulsatilla saponin. After 8 weeks of infection， The serum of all mice were measured the value of ALT and AST;body weight and liver weight of the mice were weighed;αSMA expression was observed by immunohistochemistry. [Result] The body weight， liver weight， ALT and AST content of the pulsatilla saponin group were significantly different from those of the positive control group. The expression of αSMA in the liver of the pulsatilla saponin group was significantly lower than that of the positive control group. [Conclusion] The pulsatilla saponin by intraperitoneal injection can significantly reduce the degree of liver fibrosis caused by Schistosoma japonicum.

Key words Pulsatilla saponin;Hepatic fibrosis;ALT;AST;αSMA

作者簡介 陳巖勤（1972—），女，河南南陽人，副教授，博士，從事感染與免疫方向的研究。*通信作者，副教授，博士，從事藥物分析研究。

收稿日期 2019-03-04;修回日期 2019-03-21

血吸蟲病是一種慢性蟲卵肉芽腫的免疫病理反應，沉積于肝微血管內(nèi)的大量蟲卵以及宿主對蟲卵的炎癥反應和纖維化為血吸蟲病的主要病變[1]。目前治療血吸蟲病的有效藥物是吡喹酮，但經(jīng)過殺蟲治療后，肝組織中的沉積蟲卵繼續(xù)釋放蟲卵可溶性抗原激活一系列導致肝臟病變的信號通路，使肝臟蟲卵肉芽腫持續(xù)出現(xiàn)并誘導肝纖維化[2]。在肝纖維化過程中肝星狀細胞由靜止狀態(tài)轉變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，膠原蛋白分泌增多，α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）合成增多，肝臟損傷的同時調(diào)動多種與免疫相關細胞的應答以及細胞間的浸潤，加速肝纖維化的發(fā)生[3]。臨床上丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）常作為觀察肝病患者疾病發(fā)展及預后的一個指標，是檢測肝功能最敏感的指標之一，在一定程度上作為肝纖維化的診斷、治療的動態(tài)變化的參考[4]。

白頭翁為毛茛科植物白頭翁的干燥根，作為中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒，味苦，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲的功效[5];尚有文獻報道其在抗腫瘤[6-9]、抗病毒[10]等方面的藥理作用;路西明等[11]研究發(fā)現(xiàn)白頭翁對異煙肼和利福平引起的血清ALT升高有對抗作用，且能對抗藥物引起的肝細胞死亡，具有保肝作用。因此探索白頭翁皂苷在干預血吸蟲肝纖維化發(fā)展進程中的作用，期望從白頭翁皂苷對血吸蟲病所致的肝纖維化著手來研究其作用機制，為肝纖維化的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和釘螺

C57BL/6小鼠，雌性，由蘇州大學實驗動物中心提供，體重18～20 g;陽性釘螺（O.hupensis）購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2 藥品試劑及儀器

白頭翁皂苷由蘇州大學醫(yī)學部藥學院楊世林教授課題組提供;0.9%生理鹽水購自江蘇四環(huán)生物股份有限公司;ALT、AST試劑盒購自南京建成生物技術公司;20 mg/mL 白頭翁皂苷注射液用無菌生理鹽水溶解200 mg PRS定容至100 mL經(jīng)無菌抽濾后分裝4 ℃儲存?zhèn)溆?。?SMA一抗購自武漢博士德生物工程有限公司;二抗免疫組化試劑盒購自上海基因科技有限公司;XD-811半自動生化分析儀為上海迅達醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品;德國Leica公司產(chǎn)UC6病理切片機。

1.3 方法

用去氯水25 ℃浸泡釘螺白熾燈下照射逸出尾蚴。將30只小鼠隨機平均分為陰性對照組、陽性對照組、白頭翁皂苷組，采用腹部貼片法感染尾蚴40條;感染6周后，白頭翁皂苷組每日按劑量200 mg/kg腹腔注射白頭翁皂苷藥物，陰性對照組、陽性對照組按0.02 mL/g容量給小鼠腹腔注射生理鹽水。8周后，禁食12 h，小鼠眼眶靜脈叢采血，離心，取血清測定ALT、AST含量;取肝臟稱重，并取左葉組織1 cm3置入10%中性甲醛溶液中，4 ℃冰箱中固定24 h制作石蠟切片用于免疫組化檢測α-SMA表達。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有試驗數(shù)據(jù)用±S表示，利用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組件比較利用t檢驗評價，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重及肝臟重量的變化

從表1可看出，經(jīng)過白頭翁皂苷治療后第8周末，陽性對照組與陰性對照組相比，陽性對照組體重顯著降低（P<0.05）;白頭翁皂苷組比陽性對照組體重升高顯著（P<0.05）;陽性對照組肝重與陰性對照組相比顯著升高（P<0.05）;白頭翁皂苷組與陽性對照組比較肝重下降顯著（P<0.05）。

2.2 血清ALT、AST含量的變化

從表2可看出，陽性對照組小鼠血清中ALT、AST含量均顯著高于陰性對照組（P<0.05）;白頭翁皂苷組小鼠血清中ALT、AST含量均顯著低于陽性對照組（P<0.05）。

2.3 小鼠肝臟免疫組化結果

肝臟α-SMA免疫組化顯示（圖1），陰性對照組少有α-SMA表達;陽性對照組α-SMA表達主要集中在蟲卵內(nèi)部及周圍區(qū)域，著色明顯深于白頭翁皂苷組α-SMA的表達。

3 討論與結論

日本血吸蟲感染小鼠引起肝臟纖維化的病理模型與人類血吸蟲病肝纖維化極為相似，以此為研究對象研究開發(fā)治療或逆轉肝纖維化的藥物具有重要的意義。有學者認為肝纖維化可以逆轉，肝硬化不可逆轉，在血吸蟲肝病的早期應用抗纖維化的治療措施有利于肝纖維化的逆轉。該研究建立了血吸蟲病肝纖維化小鼠模型，利用白頭翁皂苷腹腔給藥發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低血吸蟲病小鼠血清中ALT和AST的含量。而ALT和AST能夠敏感體現(xiàn)肝細胞膜損傷的程度，肝細胞膜損傷后會使ALT和AST進入血液，從而使小鼠血清中AIT和AST升高。所以血清中ALT和AST數(shù)值的大小可以間接地反映出肝細胞受損的程度。試驗結果顯示白頭翁皂苷能夠有效降低ALT和AST水平。肝星狀細胞活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，α-SMA表達是肝星狀細胞激活的標志，其表達量直接與肝纖維化程度相關聯(lián)。通過對白頭翁皂苷對血吸蟲病引起的肝纖維化的治療研究發(fā)現(xiàn)其能減弱肝纖維化的進展，為其能夠成為治療肝纖維化藥物打下基礎。

參考文獻

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