趙志敏+劉成海

摘 要 扶正化瘀方是治療肝纖維化的有效中藥復(fù)方，本文綜述了扶正化瘀方抗肝纖維化的主要作用機(jī)制及其效應(yīng)物質(zhì)，包括該方影響肝臟多種細(xì)胞的功能及細(xì)胞外基質(zhì)代謝，其入血成分、活性物質(zhì)及其組織分布代謝特征。

關(guān)鍵詞 扶正化瘀方 肝纖維化 作用機(jī)制 效應(yīng)物質(zhì)

中圖分類號：R286 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）13-0013-04

The main mechanism and the substantial basis of FZHY recipe in the treatment of hepatic fibrosis*

ZHAO Zhimin1，2**， LIU Chenghai1，2，3***（1. Institute of Liver Diseases， Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine， Shanghai 201203， China； 3. E-institute of TCM Internal Medicine， Shanghai Municipal Education Commission， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Fuzheng Huayu recipe （FZHY） is an effective traditional Chinese medicine for the treatment of liver fibrosis.

This review summarizes the main mechanism and the substantial basis of FZHY recipe in the treatment of hepatic fibrosis， including its effects on the function of multiple types of cells in liver and extracellular matrix metabolism， the blood components and active substances and their characteristics of tissue distribution and metabolism.

KEY WORDS FZHY recipe； liver fibrosis； mechanism； substantial basis

肝纖維化的中醫(yī)基本病機(jī)為“正虛血瘀”，正虛主要表現(xiàn)為氣陰兩虛，血瘀則主要表現(xiàn)為瘀血阻絡(luò)。扶正化瘀方（制劑為扶正化瘀膠囊/片）立足于中醫(yī)“血瘀阻絡(luò)、正氣虧虛”的基本病機(jī)，由丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子等6味中藥組成?？筛纳聘窝缀蟾斡不颊吒喂δ?、調(diào)整異常免疫功能和降低血清肝纖維化標(biāo)志物水平等，對乙肝肝纖維化的組織學(xué)逆轉(zhuǎn)率達(dá)52%，且肝組織炎癥活動度也有明顯改善[1]。抗丙肝肝纖維化美國多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)也顯示出該藥良好作用。對其主要作用機(jī)制與效應(yīng)物質(zhì)，近年也有較多研究，歸納于下。

1 扶正化瘀方影響肝纖維化的作用機(jī)制

1.1 抑制肝星狀細(xì)胞活化

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，其激活途徑包括肝細(xì)胞損傷后形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）改變與肝庫普弗細(xì)胞等激活后分泌細(xì)胞因子的旁分泌刺激，以及星狀細(xì)胞活化后自身分泌細(xì)胞因子以刺激與維持細(xì)胞活化的自分泌作用，細(xì)胞因子以轉(zhuǎn)化生長因子-b1（transforming growth factor β1，TGF-b1）與血小板衍生生長因子bb（platelet derived growth factor-bb，PDGF-bb）作用尤為顯著。扶正化瘀方抑制纖維化大鼠肝組織a-平滑肌肌動蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）表達(dá)，其藥物血清抑制正常傳代活化、體外PDGF-bb刺激活化與肝纖維化大鼠體內(nèi)活化的HSC增殖[2]，即抑制HSC活化，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞分子藥理機(jī)制如下。

1）抑制HSC的自分泌活化 5%～20%扶正化瘀藥物血清能濃度依賴性抑制傳代活化HSC細(xì)胞內(nèi)外膠原生成率，尤其以抑制細(xì)胞外膠原分泌率最為顯著，并抑制I型膠原的分泌量及其I型前膠原mRNA表達(dá)[3]?；罨菭罴?xì)胞的條件培養(yǎng)液可顯著促進(jìn)靜止星狀細(xì)胞的增殖與I型膠原分泌，但經(jīng)藥物血清溫育條件培養(yǎng)液后，靜止星狀細(xì)胞的促細(xì)胞增殖與膠原生成作用則明顯減弱[4]。表明扶正化瘀方抑制活化星狀細(xì)胞的功能，并通過抑制其自分泌作用，阻斷活化的級聯(lián)反應(yīng)，從而阻止肝纖維化的持續(xù)發(fā)展。

2）抑制庫普弗細(xì)胞的旁分泌 以CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型，而后分離培養(yǎng)體內(nèi)激活的庫普弗細(xì)胞，繼以扶正化瘀方藥物血清溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物血清抑制庫普弗細(xì)胞（kupffer cell，KC）培養(yǎng)上清中TGF-b1與PDGF的活性，而且經(jīng)藥物血清作用后的KC培養(yǎng)上清對靜止星狀細(xì)胞的促增殖作用明顯減弱[5]。說明扶正化瘀方可通過抑制KC的激活及其旁分泌作用，而抑制星狀細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

3）抑制纖維粘連蛋白（fibronectin， FN）/整合素信號途徑 肝損害早期FN增加可明顯促進(jìn)HSC活化，而HSC激活后又可生成FN[6]，HSC與胞外基質(zhì)密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方可明顯抑制FN刺激的HSC增殖活化，抑制細(xì)胞的整合素蛋白的表達(dá)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）磷酸化與黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）活性，從而干預(yù)整合素的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，干擾FN與HSC的相互聯(lián)系，抑制FN的促HSC增殖活化，而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

1.2 保護(hù)肝細(xì)胞過氧化損傷與凋亡

損傷肝細(xì)胞是肝纖維化發(fā)生的病理啟動因素，防止肝細(xì)胞過氧化損傷與肝細(xì)胞凋亡是抗肝纖維化的重要環(huán)節(jié)。CCl4可導(dǎo)致明顯的肝臟脂質(zhì)過氧化損傷與肝纖維化，對于CCl4中毒肝纖維化大鼠，扶正化瘀方明顯減輕肝細(xì)胞變性壞死、促進(jìn)肝功能恢復(fù)；顯著提高肝組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛含量；且這些作用與降低肝組織羥脯氨酸含量，即抗肝纖維化作用呈相同趨勢[7]。并且扶正化瘀方可明顯抑制纖維化肝組織ERK1/2磷酸化水平與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2/9活性。二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）化學(xué)中毒也可通過脂質(zhì)過氧化途徑導(dǎo)致肝纖維化[8]，扶正化瘀方對該模型也有良好的抗肝臟脂質(zhì)過氧化與肝纖維化作用。

體外分離培養(yǎng)正常大鼠肝細(xì)胞，經(jīng)CCl4刺激損傷，同時(shí)以扶正化瘀方藥物血清溫育細(xì)胞48 h，結(jié)果該含藥血清明顯促進(jìn)體外損傷肝細(xì)胞的功能恢復(fù)。采用脂多糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡小鼠模型與體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡模型，扶正化瘀方及其藥物血清可明顯抑制整體動物與培養(yǎng)肝細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)凋亡/抗凋亡因子、抑制半胱氨酸3活性等有關(guān)。提示抗肝細(xì)胞凋亡是扶正化瘀方抗肝纖維化的重要作用機(jī)制之一[9]。

1.3 調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞胞外基質(zhì)代謝與血管新生

纖維化時(shí)，肝臟細(xì)胞胞外基質(zhì)代謝與血管新生密切相關(guān)。在肝竇毛細(xì)血管化大鼠模型中，肝臟間質(zhì)性MMP13蛋白表達(dá)與活性明顯下降，纖溶酶酶原激活劑的抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）表達(dá)增加，酶活性抑制物金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）表達(dá)上升；門脈壓力升高，肝竇內(nèi)皮失窗孔與基底膜連續(xù)化。扶正化瘀方可明顯減少PAI-1與TIMP1、TIMP2蛋白表達(dá)，提高M(jìn)MP13活性水平；降低血清透明質(zhì)酸水平與減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善肝竇毛細(xì)血管化，減輕門脈壓力[10]。進(jìn)一步以具有抗肝纖維化作用的血管新生抑制劑索拉非尼為對照，觀察扶正化瘀方對纖維化肝臟血管新生的作用，并圍繞血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、MMP2/9活性變化、肝星狀細(xì)胞活化與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞去分化等探討相關(guān)作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方與索拉非尼能明顯減輕小鼠肝纖維化，同時(shí)，血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）與血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）陽性表達(dá)的微血管數(shù)量明顯減少，該方能夠抑制纖維化肝臟的肝竇內(nèi)皮失窗孔和連續(xù)性基底膜形成，提示有抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞去分化作用。內(nèi)皮下基底膜降解是血管新生的生化基礎(chǔ)，缺氧誘導(dǎo)因子1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）調(diào)節(jié)的VEGF/MAPK信號通路是其重要分子機(jī)制，扶正化瘀方能夠抑制肝臟MMP2/9活性，減少HIF-1a表達(dá)，抑制VEGF及其受體表達(dá)，下調(diào)ERK-1/2磷酸化。結(jié)果說明扶正化瘀方具有抑制肝纖維化小鼠的肝血管新生作用，該作用是其發(fā)揮抗肝纖維化效應(yīng)的重要原因[11]。

1.4 調(diào)節(jié)纖維化肝臟差異表達(dá)的蛋白質(zhì)組、mRNAs與miRNAs

以CCl4大鼠肝纖維化模型作為研究對象，對肝纖維化過程中血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)了10個(gè)明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中8個(gè)蛋白在肝硬化大鼠血漿中表達(dá)減少，扶正化瘀方干預(yù)后表達(dá)增加，另外2個(gè)蛋白則相反，其機(jī)制涉及促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化等多方面[12]。在以DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型肝組織中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)與纖維生成有關(guān)的蛋白，其中8個(gè)受扶正化瘀調(diào)控，與調(diào)控新陳代謝和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白及肌成纖維細(xì)胞活化相關(guān)[13]。

采用基因表達(dá)譜分析法，對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方對肝纖維化組織的差異基因數(shù)量為397個(gè)，其中上調(diào)的有195個(gè)，下調(diào)的有202個(gè)；富集的GO功能共有160條，參與調(diào)節(jié)的信號通路有17條，主要從調(diào)控纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞增殖等信號通路改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病變[14]。應(yīng)用miRNAs芯片分析扶正化瘀對CCl4纖維化小鼠肝臟miRNAs表達(dá)譜，篩選出3個(gè)扶正化瘀調(diào)控的miRNAs；信號通路分析等共得到32條這些miRNAs可能調(diào)控的信號通路，其中三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞連接、凋亡調(diào)節(jié)、Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)及小GTP酶活性調(diào)節(jié)等與肝纖維化密切相關(guān)[15]。

2 扶正化瘀方抗肝纖維化的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

圍繞扶正化瘀方的主要藥效藥物，曾發(fā)現(xiàn)該方劑的幾種抗肝纖維化成分，包括桃仁中的苦杏仁苷、丹參中丹酚酸B與蟲草菌絲中的蟲草組分等。苦杏仁苷可顯著抑制肝星狀細(xì)胞的增殖與膠原生成，與蟲草菌絲合用可顯著改善血吸蟲病患者的肝纖維化病理，苦杏仁苷單用對肝纖維化模型大鼠也有良好的改善作用[16]。其中丹酚酸B可顯著改善慢乙肝肝纖維化患者的肝纖維化[17]，可抗肝細(xì)胞過氧化損傷、抑制肝星狀細(xì)胞活化，尤其是調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞內(nèi)TGF-b1/Smads的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。

扶正化瘀方為口服給藥，其有效物質(zhì)多以血液為介質(zhì)發(fā)揮作用，因而扶正化瘀方中被吸收入血的成分可能是其體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)的關(guān)鍵所在?；诖?，我們采用液相譜/電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/ESI-MS）技術(shù)，檢測扶正化瘀方口服給藥大鼠血清中的藥物成分，共鑒定和推斷了60多種入血成分[19]。進(jìn)一步采用多種培養(yǎng)細(xì)胞、斑馬魚、與小鼠大鼠模型，評價(jià)入血成分的抗肝纖維化活性，發(fā)現(xiàn)部分活性成分，包括丹酚酸B、原兒茶醛、咖啡酸、丹參素鈉、丹酚酸A、迷迭香酸、隱丹參酮、腺苷、五味子甲素、五味子丙素、五味子酯甲等。采用UHPLC–MS/MS技術(shù)，比較扶正化瘀在正常和DMN纖維化大鼠藥代動力學(xué)及組織分布特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，模型大鼠給予扶正化瘀口服后在藥代動力學(xué)和組織分布中有明顯差異。4種扶正化瘀來源的生物活性成分丹參素鈉、丹酚酸B和迷迭香酸在模型大鼠中分別升高1.49、3.31和2.37倍；丹參素鈉、丹酚酸B、苦杏仁苷主要分布在肺、腎組織，這3種物質(zhì)在纖維化肝臟中分布明顯低于正常大鼠[20]。在此基礎(chǔ)上嘗試以方劑學(xué)君臣佐使理論為指導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)評價(jià)方法，形成了新的組分成分復(fù)方，并經(jīng)DMN肝纖維模型初步驗(yàn)證，該組分復(fù)方具有抗肝纖維化療效[21]。

3 結(jié)語

綜上所述，扶正化瘀方抗肝纖維化作用機(jī)制主要在于抑制肝星狀細(xì)胞活化；改善肝細(xì)胞過氧化損傷與肝細(xì)胞凋亡；抑制細(xì)胞外基質(zhì)代謝與抑制肝血管新生等。對該方入血成分通過采用多細(xì)胞多模型綜合篩選，發(fā)現(xiàn)了其效應(yīng)物質(zhì)，并從細(xì)胞、器官、整體等不同水平進(jìn)行活性評價(jià)，結(jié)合中醫(yī)方劑理論以血管新生為靶點(diǎn)，形成了新的組分復(fù)方并初步驗(yàn)證其有效性。這些研究實(shí)踐表明，堅(jiān)持中醫(yī)理論指導(dǎo)，結(jié)合傳統(tǒng)及臨床經(jīng)驗(yàn)擇方用藥，按照循證醫(yī)學(xué)的基本要求進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究，是探索中醫(yī)藥治療難治性疾病的有效途徑之一。而結(jié)合現(xiàn)代生命科學(xué)理論與技術(shù)，是發(fā)現(xiàn)有效中藥制劑作用原理與物質(zhì)基礎(chǔ)的重要方法。

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