劉戈+邱唯佳+費夷敏

摘 要 目的：按照2015年版《中國藥典》四部的要求進(jìn)行替硝唑栓的微生物限度檢查方法適用性試驗研究。方法：采用改進(jìn)的供試液制備方法、薄膜過濾法，進(jìn)行3次獨立平行試驗。結(jié)果：計數(shù)法驗證中， 5株菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母、黑曲霉）的回收率比值均在0.5～2范圍內(nèi)；控制菌檢查中，各陽性試驗菌均檢出，陰性對照均無菌生長。結(jié)論：替硝唑栓的微生物限度檢查方法可行。

關(guān)鍵詞 2015年版《中國藥典》 替硝唑栓 適用性試驗

中圖分類號：R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）13-0073-04

Study on microbial limit test method for tinidazole suppositories

LIU Ge*， QIU Weijia， FEI Yiming

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201802， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of the microbial limit test of tinidazole suppositories according to ChP 2015 Volume IV. Methods： Three parallel tests were carried out by applying an improved sample preparation method and membrane-filtering procedure. Results： The recovery rates of five microorganisms including Pseudomonas aeruginosa， Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were more than 50% and less than 200% by plate counting. Every positive test microorganism could be detected while negative control one could not grow in the examination of control microorganisms. Conclusion： This method for the microbial limit tests of tinidazole suppositories is feasible.

KEY WORDS ChP 2015； tinidazole suppositories； the suitability of the method

替硝唑栓具有抗原生動物和專性厭氧細(xì)菌的作用，適用于治療滴蟲性陰道炎及敏感厭氧菌所引起的細(xì)菌性陰道病，是婦科常用藥物。該品與同類產(chǎn)品甲硝唑栓相比，其臨床適應(yīng)證相同，但療效優(yōu)于甲硝唑栓，不良反應(yīng)明顯少于甲硝唑栓，所以特別適用于經(jīng)甲硝唑栓治療療效不明顯或因不良反應(yīng)難以接受甲硝唑栓治療的患者。為有效控制藥品質(zhì)量，保證微生物限度檢查方法的科學(xué)性和檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)2015年版《中國藥典》四部微生物限度檢查的新要求[1]，對替硝唑栓進(jìn)行了微生物限度檢查的方法適用性試驗研究[2]。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

胰酪胨大豆瓊脂（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂、胰酪胨大豆肉湯（TSB）、甘露醇氯化鈉瓊脂、溴化十六烷基三甲銨瓊脂和沙氏葡萄糖肉湯均來源于上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 菌種與樣品

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10104、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501、白假絲酵母（Candida albicans）CMCC（F）98001、黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003、大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102均來源于上海市食品藥品檢驗所。驗證適用性試驗所用的菌株傳代均不超過5代，采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。

替硝唑栓（上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，批號：151002、151003、151004，規(guī)格：1 g）。

1.3 儀器與設(shè)備

電動吸引器、微生物培養(yǎng)箱MJ-150-I型（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱GHP-9160型（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；蒸汽滅菌器YXQLS-50SII型（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；藥物天平BP-Ⅱ型（上海醫(yī)用激光儀器廠）；濾器、凈化工作臺、微量移液器。

1.4 方法

1.4.1 微生物計數(shù)法驗證

1.4.1.1 菌液及孢子懸液的制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中于30～35 ℃靜止培養(yǎng)18～24 h，白假絲酵母在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基于20～25 ℃靜止培養(yǎng)24～48 h，分別取少量菌液，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液，制成適宜濃度的菌懸液進(jìn)行活菌計數(shù)。

黑曲霉先在斜面培養(yǎng)基上于20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，然后加0.9%無菌氯化鈉溶液3～5 ml洗脫孢子制成孢子懸液，取少量用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.4.1.2 供試液的制備

取供試品20 g（驗證批號為替硝唑栓：151002、151003、151004）至含無菌十四烷酸異丙酯40 ml中[3]，振搖，使供試品完全溶解，然后加入45 ℃ pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨溶液200 ml，混勻，萃取，靜置，使明顯分層，用分液漏斗取水相，分裝9.9 ml若干份作為1∶10的供試液備用[4-5]。

試驗組取備用供試液1 ml，加入無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨溶液500 ml混勻，注入開放式濾器無菌過濾（Millipore混合纖維素酯濾膜，孔徑0.45 mm）[6]。用無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨溶液沖洗濾膜，每次用量100 ml，總量為500 ml[7]。在最后100 ml沖洗液中加入上述試驗微生物（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母、黑曲霉）菌液0.1 ml，平行制備2份。將含細(xì)菌和真菌的濾膜分別反貼于0.2%卵磷脂和2%聚山梨酯80胰酪胨大豆瓊脂（TSA）和沙氏葡萄糖瓊脂平皿上，于規(guī)定溫度培養(yǎng)并觀察結(jié)果[8]，分別作為計數(shù)法驗證中需氧細(xì)菌和真菌總數(shù)計數(shù)法適用性試驗。

菌液對照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗微生物并進(jìn)行微生物回收試驗[試驗組菌回收率=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)]。

供試品對照組取備用供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

中和劑對照組取相應(yīng)量稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗微生物并進(jìn)行微生物回收試驗。

1.4.2 控制菌檢查法驗證

1.4.2.1 供試品的制備

同1.4.1.2項操作至萃取，靜置，使明顯分層，用分液漏斗取水相，作為1∶10的供試液，備用。

1.4.2.2 試驗組

取三份供試液10 ml（1∶10），方法同1.4.1.2，用500 ml沖洗液沖洗，在最后100 ml沖洗液中加入試驗菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母）菌液0.1 ml（含菌量不大于100 cfu），取出濾膜，分別接種于含0.1%卵磷脂和2%聚山梨酯80的TSB肉湯500 ml[9]、TSB肉湯100 ml和沙氏葡萄糖肉湯100 ml中，按規(guī)定方法培養(yǎng)后，分別取培養(yǎng)物劃線接種，觀察結(jié)果。

1.4.2.3 陰性對照組

取供試液10 ml（1∶10），在最后100 ml沖洗液中加入試驗菌（大腸埃希菌）菌液0.1 ml（含菌量不大于100 cfu），作為上述3株菌的陰性對照，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 微生物計數(shù)法驗證

通過3次獨立平行試驗發(fā)現(xiàn)，5株試驗組菌回收率均在0.5～2范圍內(nèi)（表1），該方法經(jīng)驗證可以作為供試品計數(shù)檢查方法。其中中和劑對照組與菌液對照組的菌落數(shù)比值在0.5～2范圍內(nèi)，說明需氧菌總數(shù)計數(shù)法驗證中培養(yǎng)基中加入的中和劑0.2%卵磷脂和2%聚山梨酯80對微生物無毒性，證明該中和劑可以適用。

2.2 控制菌檢查法驗證

通過3次獨立平行試驗（1、2、3次結(jié)果相同），從表3可以看出，各陽性試驗菌均檢出，陰性對照均無菌生長，故可按此供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行控制菌檢查。

3 討論

根據(jù)《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2010年版規(guī)定：由于某些供試品具有抗菌活性，在建立測定方法或原測定方法的檢驗條件發(fā)生改變時，可能影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進(jìn)行驗證，對試驗菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗證。

替硝唑栓基質(zhì)為混合脂肪酸甘油酯，屬非水溶性基質(zhì)，且該栓劑具有較強的抑菌作用[10]，故試驗時需采用適合的方法，使非水溶性基質(zhì)均勻分散在稀釋劑中[11]，并消除供試品抑菌成分，才能真實地反映微生物污染的情況，便于檢查。

十四烷酸異丙酯為目前藥典允許使用的有機(jī)溶劑，其用法有明確的規(guī)定，在該品種供試液制備時，先用十四烷酸異丙酯使基質(zhì)分散，再用稀釋劑將樣品萃取到水相，水相薄膜過濾后截留的微生物進(jìn)行平板培養(yǎng)檢測。為消除樣品的抑菌活性，在驗證時采用開放式濾器將貼膜法與薄膜過濾法聯(lián)用、摸索出適宜的沖洗量和中和劑，個別菌采用培養(yǎng)基稀釋法等消除供試品的抑菌性。

通過進(jìn)行3次獨立平行的替硝唑栓微生物限度檢查方法的適用性試驗研究，驗證結(jié)果重現(xiàn)性好，在今后檢測中可采用此方法檢測微生物限度。

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