徐英輝， 申 茹， 郭玉巖

（1. 惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 廣東 惠州516000； 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)， 黑龍江 哈爾濱150040）

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥莖枝, 具有清熱解毒、 疏風(fēng)通絡(luò)功效, 用于溫病發(fā)熱、 熱毒血痢、 癰腫瘡瘍、 風(fēng)濕熱痹、 關(guān)節(jié)紅腫熱痛[1], 始見(jiàn)于梁代《名醫(yī)別錄》,四季均可用藥, 資源豐富[2], 其有效成分綠原酸、咖啡酸有顯著的抗菌、 抗病毒作用[3-6], 馬錢苷具有抗炎作用[7-8]。 課題組前期以綠原酸、 馬錢苷為指標(biāo), 優(yōu)化忍冬藤提取工藝[9]； 本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上, 以休止角、 堆密度、 吸濕率[10]為指標(biāo), 對(duì)忍冬藤膠囊的制備工藝進(jìn)行研究, 并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制, 以期為今后工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）； HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）； JA3003 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）； BPG-9240A 鼓風(fēng)干燥箱（上海百典儀器設(shè)備有限公司）； PS-40A 超聲波清潔機(jī)（深圳市科潔超聲科技有限公司）； ZF-7 暗箱三用紫外分析儀（上海和勤分析儀器有限公司）；AS-400 手工膠囊填充板（浙江奧爾特機(jī)械有限公司）； BZF-50 真空干燥箱 （上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥 藥用乳糖、 淀粉、 糖粉、 微晶纖維素（山東聊城華陽(yáng)醫(yī)藥輔料有限公司）； 1 號(hào)空心膠囊（吉林敖東順合膠囊有限公司）。 忍冬藤 （批號(hào)160601） 購(gòu)自亳州市宏大中藥飲片有限公司, 產(chǎn)地山東, 經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室祁銀德副教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥莖枝。 綠原酸（批號(hào)170309）、 馬錢苷（批號(hào)170308） 對(duì)照品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。 甲醇、 乙腈為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水。

2 制備工藝

2.1 輔料篩選 以濃縮稠膏進(jìn)行減壓干燥時(shí)發(fā)現(xiàn),干燥后呈塊狀黏連固體, 而且容易吸潮, 不利于膠囊劑填充, 故選擇濕法制顆粒。

2.1.1 單一輔料 取稠膏5 g, 加入一定量的淀粉、 微晶纖維素、 乳糖、 糖粉混合制粒, 以休止角、 吸濕性、 綠原酸及馬錢苷含有量、 成型狀態(tài)為考察指標(biāo)進(jìn)行篩選, 結(jié)果見(jiàn)表1。 由表可知, 以上輔料均符合流動(dòng)性與吸濕性的要求, 其中微晶纖維素流動(dòng)性最好, 乳糖吸濕性最好, 微晶纖維素成分含有量最高, 而在輔料用量方面, 糖粉用量最大,可排除； 淀粉用量稍大, 但價(jià)格低廉； 微晶纖維素用量較少, 但其成本高, 不利于產(chǎn)業(yè)化。 綜合考慮, 需將輔料混合后作進(jìn)一步考察。

表1 單一輔料考察結(jié)果Tab.1 Results of single excipient investigation

2.1.2 混合輔料 取稠膏5 g, 加入不同比例混合的微晶纖維素、 淀粉、 乳糖制備濕顆粒, 以休止角、 吸濕性、 綠原酸及馬錢苷含有量、 成型狀態(tài)為考察指標(biāo)進(jìn)行篩選, 結(jié)果見(jiàn)表2。 由表可知, 不同比例下顆粒休止角均小于30°, 顆粒流動(dòng)性較好,符合吸濕性制劑要求, 其中微晶纖維素與淀粉混合時(shí)輔料用量少, 顆粒成型性好； 隨著微晶纖維素中淀粉量提高, 輔料用量隨之增加, 綠原酸、 馬錢苷含有量隨之降低, 其中微晶纖維素-淀粉比例為3 ∶1時(shí)兩者含有量最高, 而且顆粒適中。 綜合考慮有效成分含有量和患者服用量, 最終選擇混合輔料為微晶纖維素-淀粉（3 ∶1）, 稠膏與輔料的比例約為1 ∶1.1。

表2 混合輔料考察結(jié)果Tab.2 Results of mixed excipient investigation

2.2 膠囊型號(hào)篩選

2.2.1 堆密度 精密稱取3 份顆粒（質(zhì)量m）, 填充于10 mL 量筒中, 由5 cm 高度落在木板上, 反復(fù)振動(dòng)3 次后測(cè)定體積（V）, 根據(jù)公式ρ=m/V 計(jì)算 堆 密 度, 測(cè) 得 其 分 別 為 0.374、 0.380、0.374 g/mL, 平均0.376 g/mL （RSD=0.921%）。

2.2.2 膠囊裝量 《中國(guó)藥典》 規(guī)定, 忍冬藤用量為9 ～30 g, 綠原酸、 馬錢苷含有量均不低于0.10%, 以此折算, 2 種成分用量為9 ～30 mg, 每天服用9～18 粒。 結(jié)合“2.2.1” 項(xiàng)下結(jié)果, 根據(jù)膠囊殼型號(hào)和近似容積的關(guān)系, 選擇1 號(hào)空心膠囊（近似容積為0.5 mL） 分裝, 每粒裝約0.18 g。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取藥材粗粉400 g, 按優(yōu)化工藝進(jìn)行提取, 提取液在80 ℃下減壓濃縮至相對(duì)密度為1.27 的稠膏備用, 取10、 20、 50 g, 加入混合輔料（微晶纖維素-淀粉, 3 ∶1）, 混合制粒, 考察工藝穩(wěn)定性, 結(jié)果見(jiàn)表3, 可知所得顆粒成形性理想, 大小適中, 而且工藝穩(wěn)定性好, 操作簡(jiǎn)便。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of verification tests

2.4 制備工藝 取藥材粗粉400 g, 按優(yōu)化工藝提取, 80 ℃下減壓濃縮, 得稠膏約105 g, 相對(duì)密度為1.27, 加入混合輔料 （微晶纖維素-淀粉,3 ∶1） 120 g, 制粒, 干燥, 裝入膠囊即得, 制成1 000粒。

3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.1 TLC 定性鑒別

3.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸、 馬錢苷對(duì)照品適量, 50%甲醇溶解, 制成每l mL 分別含兩者0.3、 0.57 mg 的溶液, 即得。

3.1.2 供試品溶液制備 精密稱取膠囊內(nèi)容物0.5 g, 加入10 mL 50%甲醇超聲處理30 min, 濾過(guò), 取續(xù)濾液, 即得。

3.1.3 對(duì)照藥材溶液制備 精密稱取對(duì)照藥材1 g, 加入10 mL 50%甲醇超聲處理30 min, 濾過(guò),取續(xù)濾液, 即得。

3.1.4 空白輔料溶液制備 按照處方制備空白輔料并精密稱取0.5 g, 加入10 mL 50%甲醇超聲處理30 min, 濾過(guò), 取續(xù)濾液, 即得。

3.1.5 鑒別方法 按照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)[11], 吸取空白輔料、 供試品、 對(duì)照藥材、 對(duì)照品溶液各5 μL, 在同一硅膠G 薄層板上點(diǎn)樣,以乙酸丁酯-甲醇-甲酸-水（7 ∶1 ∶2 ∶1） 為展開(kāi)劑, 展開(kāi), 取出, 晾干, 在紫外光燈 （365 nm）下檢視, 再噴以10%硫酸乙醇溶液, 于105 ℃烘箱中加熱, 斑點(diǎn)顯色清晰后停止, 在日光下檢視薄層板, 結(jié)果見(jiàn)圖1。 由圖可知, 對(duì)照藥材、 對(duì)照品、供試品色譜對(duì)應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)或斑點(diǎn), 陰性無(wú)干擾。

3.2 檢查 按照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部通則膠囊劑項(xiàng)下規(guī)定, 對(duì)膠囊進(jìn)行水分、 裝量差異、崩解時(shí)限、 微生物限度檢查。

3.2.1 水分 取3 批膠囊, 每批10 粒, 依法檢查[11], 發(fā)現(xiàn)均符合《中國(guó)藥典》 規(guī)定, 見(jiàn)表4。

3.2.2 裝量差異 取3 批膠囊, 每批20 粒, 依法檢查[11], 發(fā)現(xiàn)均符合《中國(guó)藥典》 規(guī)定, 見(jiàn)表4。

圖1 樣品TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatograms of samples

3.2.3 崩解時(shí)限 取3 批膠囊, 每批3 粒, 依法檢查[11], 發(fā)現(xiàn)均符合《中國(guó)藥典》 規(guī)定, 見(jiàn)表4。

表4 抽樣檢查結(jié)果Tab.4 Results of sampling inspection

3.3 含有量測(cè)定

3.3.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A 色譜柱（4.0 mm×250 mm, 5 μm）； 流動(dòng)相0.04%磷酸-乙腈, 梯度洗脫 （0 min, 88.5 ∶ 11.5； 14 min, 85 ∶ 15；20 min, 69 ∶31； 23 min, 10 ∶ 90）； 檢 測(cè) 波 長(zhǎng)240 nm （馬錢苷）、 327 nm （綠原酸）； 體積流量0.6 mL/min； 柱溫20 ℃； 進(jìn)樣量5 μL。

3.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸、 馬錢苷對(duì)照品適量, 50%甲醇溶解, 制成每l mL 分別含兩者0.51、 0.7 mg 的溶液, 即得。

3.3.3 供試品溶液制備 精密稱取膠囊內(nèi)容物約0.5 g, 置于具塞錐形瓶中, 加入50%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量, 超聲（功率250 W、 頻率30 kHz） 處理30 min, 放冷, 再稱定質(zhì)量, 50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量, 搖勻, 濾過(guò), 取續(xù)濾液, 即得。

3.3.4 陰性樣品溶液制備 取不含藥材提取液的空白輔料顆粒0.5 g, 按“3.3.3” 項(xiàng)下方法制備,即得。

3.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品、 樣品、 陰性樣品溶液, 在“3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖2, 可知各成分均能得到較好的分離, 陰性無(wú)干擾。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

3.3.6 線性關(guān)系考察 取綠原酸對(duì)照品母液, 依次 稀 釋 至 10.2、 25.5、 51、 127.5、 255、306 μg/mL, 在“3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下各 進(jìn) 樣5 μL測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸, 得方程Y=23 026X-57.274 （r=0.999 7）, 在10.2～306 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取馬錢苷對(duì)照品母液, 依次稀釋至7、 14、35、 70、 140、 245、 525 μg/mL, 在 “3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL 測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸,得方程Y=11 345X-11.359 （r=0.999 9）, 在7 ～525 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液, 于0、2、 4、 8、 12、 24 h 在“3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得綠原酸、 馬錢苷峰面積RSD 分別為0.24%、 0.14%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 μL,在“3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次, 測(cè)得綠原酸、 馬錢苷峰面積RSD 分別為0.11%、 0.17%,表明儀器精密度良好。

3.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱同一批供試品約0.5 g, 共6 份, 按“3.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得綠原酸、 馬錢苷含有量RSD 分別為1.54%、 1.47%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的同一膠囊9 份, 加入對(duì)照品溶液（綠原酸0.6 mg/mL、 馬錢苷1.3 mg/mL）, 按“3.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣5 μL測(cè)定, 計(jì)算回收率, 結(jié)果見(jiàn)表5～6。

表5 綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests for chlorogenic acid

3.3.11 樣品含有量測(cè)定 取5 批膠囊內(nèi)容物, 每批0.5 g, 按” 3.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,吸取對(duì)照品、 供試品溶液各5 μL, 在” 3.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算含有量, 結(jié)果見(jiàn)表7。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)薄層色譜條件進(jìn)行篩選時(shí), 采用乙酸丁酯-甲酸-水體系, 發(fā)現(xiàn)馬錢苷、 綠原酸Rf值分別為0.088、 0.188, 分離度不高； 展開(kāi)體系中有丙酮、 甲醇等極性溶劑可提高Rf值, 但加入前者時(shí)極性過(guò)大, 分離度不高, 拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重, 展開(kāi)時(shí)間較長(zhǎng), 而加入后者時(shí)成分分離度良好, 最終確定乙酸丁酯-甲醇-甲酸-水（7 ∶1 ∶2 ∶1） 作為展開(kāi)條件。 然后, 對(duì)不同點(diǎn)樣量 （3、 5、 8、 10 μL）進(jìn)行考察, 發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣量越大條帶越明顯, 但超過(guò)5 μL時(shí)會(huì)影響分離效果, 故選擇5 μL。 接著, 對(duì)不同條帶寬度（2、 4、 6、 8、 10 mm） 進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)條帶越小, 色譜圖越窄, 不能較好分離, 故選擇10 mm。 再對(duì)展開(kāi)距離、 溫度、 濕度進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)三者對(duì)薄層色譜圖均無(wú)明顯影響。

表7 各成分含有量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of content determination of various constituents

本實(shí)驗(yàn)對(duì)HPLC 色譜條件進(jìn)行篩選時(shí), 考察流動(dòng)相甲醇-0.04% 磷酸、 乙腈-0.1% 甲酸、 乙腈-0.04%磷酸, 發(fā)現(xiàn)乙腈-0.04% 磷酸洗脫時(shí)有效成分分離效果最好, 再對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化, 確定梯度洗脫比例。 結(jié)果顯示, 綠原酸、 馬錢苷保留時(shí)間適當(dāng),峰形良好, 分離度高。