楊 爽 馬文靜 高 婧 楊甲忠

（承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 河北 承德 067000）

歸脾丸[1]始載于宋代嚴(yán)用的《濟(jì)生方》，由黨參、炒白術(shù)、炙黃芪、炙甘草、茯苓、制遠(yuǎn)志、炒酸棗仁、龍眼肉、當(dāng)歸、木香和大棗（去核）11味藥組成。具有益氣健脾，養(yǎng)血安神的功效，用于心脾兩虛，氣短心悸，失眠多夢，頭昏頭暈，肢倦乏力，食欲不振，崩漏便血。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》2015年版，設(shè)置的項(xiàng)目有性狀、鑒別、檢查、含量測定，并沒有對(duì)黃曲霉毒素的限量檢測方法。由于處方中含有炒白術(shù)、炒酸棗仁等多味藥材易產(chǎn)生真菌毒素，故本文旨在研究歸脾丸黃曲霉毒素測定方法，并應(yīng)用于歸脾丸的檢測，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.儀器與試劑

1.1 Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世有限公司）；MSS40S 分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；AG135分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）

1.2 黃曲霉毒素 乙腈為色譜純（fish 有限公司）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

1.3 樣品

市場上購買35批樣品Y1-Y35，抽樣涉及6個(gè)省及直轄市生產(chǎn)企業(yè)11家，批準(zhǔn)文號(hào)14個(gè)。

2.方法與結(jié)果

2.1 色譜條

以十八烷基鍵合硅膠（5μm，4.6×250mm）為填充劑；柱溫：40℃；以甲醇（A）-乙腈（B）-水（C）為流動(dòng)相，流速1.1mL/min；采用光化學(xué)衍生法；光化學(xué)衍生器（254nm）；以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex=360nm，發(fā)射波長λem=450nm。HPLC 梯度洗脫程序T：0 ～17 ～20 ～22 ～23min，A：10 ～10 ～10 ～10 ～10，B：25 ～45 ～65 ～65 ～25，C:65 ～45 ～25 ～25 ～65。進(jìn)樣量 ：對(duì)照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，供試品溶液25μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取黃曲霉毒素對(duì)照品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，標(biāo)示濃度1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL）0.5mL，置10mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1mL,置25mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，精密稱取水蜜丸9g，蜜丸15g，剪碎，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，超聲處理15分鐘使之分散均勻，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11000轉(zhuǎn)/分鐘），離心5分鐘（離心速度2500轉(zhuǎn)/分鐘），精密量取上清液15ml，置50ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用玻璃纖維濾紙濾過，精密量取續(xù)濾液20ml，通過免疫親和柱，流速每分鐘3ml，用水20ml洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液置2ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定法

按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，以混合對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，不同進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另測定供試品峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計(jì)算，即得。

2.4 回收率

精密稱取取Y1，3份各9g，剪碎，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3g，精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5mL 加入均質(zhì)瓶中，按照2.2.2供試品溶液的制備，按照2色譜條件測定，計(jì)算回收率，分別為87.5%，90.1%，90.5%，符合要求。

2.5 結(jié)果

35批次樣品中有8批次檢出黃曲霉毒素，并經(jīng)質(zhì)譜驗(yàn)證。對(duì)照?qǐng)D譜見圖1，樣品圖譜(檢出）見圖2、(未檢出）見圖3。檢出數(shù)據(jù)見表1。

限度：按人體口服安全有效量制定，每1000g 含黃曲霉毒素B1不得過5μg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2 和黃曲霉毒素B1的總量不得過10μg。

圖1 黃曲霉毒素混合對(duì)照品HPLC圖譜

圖2 Y15（批號(hào)160901）HPLC圖譜

圖3 Y10（批號(hào)17031005）HPLC圖譜

表1 8批次樣品檢出黃曲霉毒素?cái)?shù)據(jù)表

結(jié)果：經(jīng)檢驗(yàn)，35次樣品全部符合規(guī)定。

3.討論

黃曲霉毒素(AFT)是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉 (aspergillus flavus)寄生曲霉 (a.parasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。它們存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中，特別是容易污染花生、桃仁，酸棗仁等油性大的植物中，是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡.以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)。B1是最危險(xiǎn)的致癌物，經(jīng)常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能檢測到。它們?cè)谧贤饩€照射下能產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同，將其分為B 族和G 族兩大類及其衍生物。

本文采用中國藥典中藥材黃曲霉毒素的檢查方法對(duì)成藥歸脾丸中黃曲霉毒素進(jìn)行檢查，回收率為87.3%，說明此方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可以直接應(yīng)用于歸脾丸。

本文應(yīng)用此方法對(duì)35批歸脾丸黃曲霉毒素進(jìn)行檢查，結(jié)果有8批歸脾丸檢查出黃曲霉毒素，雖然都在人體中毒的限度內(nèi)，但是有個(gè)別企業(yè)含量也偏高，而且同一廠家不同批號(hào)都含有黃曲霉毒素，要提高對(duì)個(gè)別企業(yè)的監(jiān)管力度。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有必要增加對(duì)黃曲霉毒素的檢查，控制歸脾丸的質(zhì)量，提高人民的用藥安全。