林史珍 ，杜方敏 ，林良靜 ，高向陽(yáng) ，3△

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510642； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院·廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642； 3.華農(nóng) ＜潮州 ＞食品研究院有限公司，廣東 潮州 521000）

苦杏仁和桃仁皆是常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為薔薇科植物山杏Prunus armeniacaL.var.ansu Maxim和植物山桃Prunus daridianaCarr.Franch的干燥成熟種子[1-2]，具有鎮(zhèn)咳平喘、潤(rùn)腸通便、抗腫瘤和抗凝血等功效[3-6]。但因苦杏仁和桃仁是富油果仁，貯存過(guò)程中易走油，致使不飽和脂肪酸和苦杏仁苷含量減少，嚴(yán)重影響苦杏仁和桃仁的品質(zhì)。早期采用經(jīng)典恒溫法、初勻速法等加速試驗(yàn)?zāi)M中藥變質(zhì)規(guī)律[7-10]，但效果不理想。拱健婷[11]基于留樣和加速試驗(yàn)結(jié)合感官、氣味建立了相對(duì)有效的加速模型。閻敏等[3]利用正交設(shè)計(jì)法考察了貯存條件對(duì)苦杏仁質(zhì)量的影響，并得出苦杏仁最佳貯存條件。顏永剛[12]對(duì)桃仁的品種、品質(zhì)和藥效之間進(jìn)行了相關(guān)性分析，初步建立了評(píng)價(jià)桃仁質(zhì)量的數(shù)學(xué)模型。張清安等[13]考察苦杏仁多酚氧化酶（PPO）粗提物的理化特性得出了苦杏仁中PPO最適溫度為40℃。趙麗瑩等[14]建立了苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定最優(yōu)條件。杏仁中含有酚酸類(lèi)物質(zhì)和多酚氧化酶，在一定條件下會(huì)發(fā)生氧化褐變，從而影響杏仁的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13]。本研究中探討了苦杏仁和桃仁貯存過(guò)程中品質(zhì)與酶活性變化的相互關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1. 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：FUSE 15A型種子老化箱（浙江托普儀器公司）；LC-15C型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV5100B型紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器公司）；FA20048型電子天平（上海佑科儀器公司）；114搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安永歷制藥公司）。

試藥：苦杏仁苷對(duì)照品（大連美倫生物技術(shù)有限公司，純度大于98%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；苦杏仁、桃仁（康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為180601391，180402021），經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥標(biāo)本館主任劉基柱鑒定為正品。

1.2 方法

1.2.1 苦杏仁苷含量測(cè)定方法

溶液制備：取苦杏仁、桃仁樣品適量，粉碎，過(guò)2號(hào)篩，分別稱(chēng)取苦杏仁粉末化各0.25 g置錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲30 min，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取濾液5 mL，加50%甲醇定容至25 mL，取濾液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。取適量苦杏仁苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為300 mg／L的母液，即得對(duì)照品溶液。

色譜條件：色譜柱為Phenomenx-C18柱（250 mm×4.6nm，5μm）；A泵-水、B泵-乙腈，梯度洗脫（洗脫程序?yàn)?～8 min時(shí)10% ～26%B泵，8～15 min時(shí) 26% ～28%，15～18 min時(shí)28%）；檢測(cè)波長(zhǎng)207nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

油脂含量測(cè)定：參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》（通則 0713）方法。

酸價(jià)測(cè)定：參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》（通則2303）方法。

過(guò)氧化值測(cè)定：參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》（通則 2303）方法。

多酚氧化酶活性測(cè)定：參考LS／T6124-2017。

β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定[14]：稱(chēng)取苦杏仁和桃仁各 0.5 g，PVP 0.5 g，精密稱(chēng)定，加入適量 pH 5.0 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，冷凍離心，取上清液，得粗酶液。在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，加入粗酶液、50 mmol／L 硝基苯 -β -D-葡萄糖苷，于 pH 5.0、50℃反應(yīng)30 min。加入1 mol／L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，在400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。酶活單位定義為該反應(yīng)條件下，每g樣品每分鐘吸光度值變化0.001為1個(gè)β-葡萄糖苷酶活力單位，以U表示。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均取3次測(cè)定結(jié)果的平均值，并采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 高溫高濕加速破壞

苦杏仁、桃仁的油脂含量和氧化酸敗程度：將苦杏仁、桃仁樣品放置在35℃、相對(duì)濕度80%的高溫高濕條件下，以樣品出現(xiàn)微生物菌絲、呈現(xiàn)長(zhǎng)菌狀態(tài)停止取樣，監(jiān)測(cè)其油脂含量、酸價(jià)、過(guò)氧化值變化，詳見(jiàn)圖1 A至圖1 C。樣品在溫度35℃、相對(duì)濕度80%條件下放置5 d時(shí)開(kāi)始長(zhǎng)菌，分別取放置1，3，4 d的苦杏仁和桃仁樣品，以未處理樣品為對(duì)照。在此高溫高濕條件下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，苦杏仁和桃仁中油脂含量不斷降低，苦杏仁樣品從59%降至47%，桃仁樣品從59%降至37%；酸價(jià)和過(guò)氧化值則不斷升高。這是因?yàn)闇囟仍礁撸瑵穸仍酱?，溶解在水中的氧氣增多，油脂發(fā)生酸敗的情況增大，導(dǎo)致油脂過(guò)氧化值上升，且濕度大，脂肪發(fā)生水解，脂肪酸含量上升，導(dǎo)致酸價(jià)上升。其中桃仁的油脂含量比苦杏仁下降得多，酸價(jià)整體也比苦杏仁高。說(shuō)明桃仁較于苦杏仁“走油”現(xiàn)象和油脂氧化程度要明顯。

圖1 苦杏仁和桃仁指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

苦杏仁苷含量變化：苦杏仁苷含量是苦杏仁、桃仁品質(zhì)的重要指標(biāo)，故監(jiān)測(cè)苦杏仁、桃仁在高溫高濕條件下苦杏仁苷含量的變化，詳見(jiàn)圖1 D。可見(jiàn)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，苦杏仁、桃仁的苦杏仁苷含量不斷下降，前者苦杏仁苷從67 mg／g降至55 mg／g，后者苦杏仁苷含量從 58 mg／g降至 55 mg／g。

2.2 β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶的酶活力變化

由圖1 E和圖1 F可知，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，苦杏仁、桃仁主要活性物質(zhì)苦杏仁苷含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨之而來(lái)的是發(fā)生霉變和褐變。因β-葡萄糖苷酶可以將苦杏仁苷分解成苯甲醛和氫氰酸等物質(zhì)[15]，使其含量下降；多酚氧化酶為酶促褐變的主要酶源[16]。故監(jiān)測(cè)與之相關(guān)的2種酶活性變化，可發(fā)現(xiàn)苦杏仁、桃仁品質(zhì)變化與酶活性之間的聯(lián)系。

在高溫高濕條件下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，苦杏仁、桃仁β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，前3d緩慢上升，4 d急劇上升，分別達(dá) 571 400 U／g和 472 131 U ／g，與圖1 D結(jié)果相符；多酚氧化酶活性也是先升高后下降，放置3 d達(dá)到最高值，分別為1 623 U／g和1 491 U／g，隨后有下降趨勢(shì)。第4天，苦杏仁和桃仁樣品開(kāi)始出現(xiàn)白色菌絲，且2種酶的酶活性在第4天均出現(xiàn)了明顯變化，可能與樣品內(nèi)部微生物活動(dòng)有關(guān)。說(shuō)明在高溫高濕環(huán)境下β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶的活力均上升明顯?？嘈尤省⑻胰?個(gè)樣品之間的2種酶變化趨勢(shì)一致，無(wú)明顯差異。

3 討論

在高溫高濕加速破壞條件下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，苦杏仁、桃仁所含油脂含量呈下降趨勢(shì)，其酸價(jià)和過(guò)氧化值呈上升趨勢(shì)，其功能活性物質(zhì)苦杏仁苷含量分別下降了17.9%和5.2%；苦杏仁和桃仁中β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶活力均有明顯上升趨勢(shì)，其中β-葡萄糖苷酶在第4天酶活力分別達(dá)571 400 U／g和472 131 U／g；多酚氧化酶活性放置第3天分別達(dá)1623U／g和1491U／g。表明β-葡萄糖苷酶活性升高是使苦杏仁苷含量下降，以致其藥效下降甚至喪失的主要原因；多酚氧化酶是導(dǎo)致苦杏仁和桃仁褐變的主要原因。2種酶活性的變化與在高溫高濕條件下中藥內(nèi)部微生物活動(dòng)有關(guān)。研究結(jié)果表明，在高溫高濕條件下，苦杏仁和桃仁品質(zhì)指標(biāo)下降，與之相關(guān)的2種酶的活性明顯上升，反映苦杏仁、桃仁在貯存過(guò)程中品質(zhì)變化和酶活性的變化規(guī)律，根據(jù)測(cè)定酶活性判斷苦杏仁、桃仁品質(zhì)變化情況，為苦杏仁和桃仁在實(shí)際貯存過(guò)程中通過(guò)酶活性預(yù)測(cè)品質(zhì)變化提供了參考依據(jù)。從控制酶的活性來(lái)保障苦杏仁、桃仁和其他富油果仁貯存品質(zhì)，值得進(jìn)一步研究。