高麗霞

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300）

桑黃Phellinus igniarius.，別名火木層孔菌、針層孔菌、桑耳、鮑氏層孔菌、針裂蹄。與擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科層孔菌的屬性相同[1]。通常生長(zhǎng)在楊樹(shù)、桑樹(shù)、柳樹(shù)、白樺樹(shù)等闊葉樹(shù)上。桑黃具備較好的化瘀功能，中醫(yī)領(lǐng)域通常會(huì)用它處理血崩、血淋等病癥[2]。受到寄生樹(shù)種差異性的影響，桑黃性狀具有一定區(qū)別[3]。國(guó)外相關(guān)研究人員認(rèn)為，生長(zhǎng)在桑樹(shù)上且樹(shù)齡大于30年的桑黃即為正品桑黃，藥性較優(yōu)。正品桑黃顏色尤其鮮黃，以淡黃色為主。隨著桑黃需求量逐漸增多，市場(chǎng)價(jià)格也逐漸提升，導(dǎo)致每個(gè)產(chǎn)地桑黃都被大肆開(kāi)采，且桑樹(shù)容易感染青枯病，桑樹(shù)桑黃便逐漸出現(xiàn)供不應(yīng)求的情況[4-5]。因此，人工栽培與發(fā)酵培養(yǎng)桑黃，是桑黃培養(yǎng)問(wèn)題的重中之重。發(fā)酵菌粉具有生產(chǎn)時(shí)間短、生產(chǎn)速度快的優(yōu)勢(shì)，是獲取桑黃這種珍稀藥用真菌成本最低、最為便捷的方法。隨著植物基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，新型桑樹(shù)的產(chǎn)量出現(xiàn)量的提升?？瓜x(chóng)、抗病等基因的引入，會(huì)提升桑樹(shù)的產(chǎn)量以及桑黃的質(zhì)量[6-7]。將抗菌肽基因?qū)肷?shù)苗，獲取抗病新型桑樹(shù)苗，提升桑樹(shù)苗的抗病性，并研究發(fā)酵新型桑樹(shù)苗提取新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉，確保新型桑樹(shù)的優(yōu)良性狀得以遺傳。

1 抗病新型桑樹(shù)的培養(yǎng)

1.1 新型桑樹(shù)苗的培養(yǎng)

1.1.1 子葉

實(shí)驗(yàn)品種是豐馳桑[8]。它的種子根據(jù)常規(guī)方法采集后，放置6℃溫度下儲(chǔ)存。使用時(shí)獲取合適的分量在室溫下浸泡1 d[9]，再放置流水里沖洗40 min，采用70%乙醇進(jìn)行6 min左右的消毒，然后使用0.2%HgCl2消毒30 min，通過(guò)無(wú)菌水多次清洗后放在無(wú)菌濾紙上進(jìn)行干燥處理，放置1/2 MS培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中放置2 h左右，提取子葉。

1.1.2 農(nóng)桿菌

所用農(nóng)桿菌（Agrobacterium） 是載體pTYB的胭脂堿型農(nóng)桿菌。pTYB載體具備嶄新的抗菌肽shivA基因。此菌在具有四環(huán)素20 mg·L-1與卡那霉素40 mg·L-1的LB液體培養(yǎng)基里振動(dòng)培養(yǎng)24 h。菌液通過(guò)4 000 r·min-1離心10 min，使用MS1液體培養(yǎng)基稀釋后便可使用[6]。

1.1.3 轉(zhuǎn)化處理

將上述提取的子葉使用稀釋后的農(nóng)桿菌浸泡15 min（對(duì)照組的子葉采用MS1液體培養(yǎng)基浸泡15 min），將子葉放在無(wú)菌濾紙上去除無(wú)關(guān)菌液，再放置具有2層無(wú)菌濾紙的MS1固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h。

1.1.4 篩選培養(yǎng)

子葉培養(yǎng)4 h后，放置具有羧芐青霉素（Cd）與卡那霉素（Km）的MSI培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)換細(xì)胞獲取不定芽。等不定芽生長(zhǎng)到3 cm~4 cm時(shí)，把它放置在具有 Cb 60 mg·L-1與 Km 20 mg·L-1的培養(yǎng)基里培養(yǎng)生根。

1.1.5 DNA點(diǎn)雜交

雜交探針的標(biāo)識(shí)根據(jù)Promega試劑盒說(shuō)明書(shū)實(shí)行，獲取新型桑樹(shù)苗。

1.1.6 培養(yǎng)基

MS1培養(yǎng)基里存在8 p維生素、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤） 4.0 mg·L-1、IAA （吲哚乙酸） 0.4 mg·L-1、葡萄糖40 g·L-1、以及具有水解乳蛋白500 mg·L-1的MS培養(yǎng)基；MS2培養(yǎng)基中具有6-BA 2.0 mg·L-1。

1.2 新型桑樹(shù)抗病性測(cè)定

1.2.1 抗病性測(cè)試方法

獲取的新型桑樹(shù)苗一部分放置土壤里，等其生長(zhǎng)至50 cm時(shí)，實(shí)行青枯病菌針刺接種，剩余部分采用1/3 MS無(wú)機(jī)鹽溶液實(shí)行無(wú)土栽培方式，實(shí)驗(yàn)試菌屬于桑青枯病順德型菌株。青枯菌培養(yǎng)48 h后，采用滅菌蒸餾水配比濃度依次是1×108個(gè)/mL、5×108個(gè)/mL、1×109個(gè)/mL的菌液，并采用滅菌水設(shè)成空白對(duì)照。

1.2.2 抗病性測(cè)定結(jié)果

新型桑樹(shù)抗病性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 新型桑樹(shù)抗病性測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination of disease resistance of new mulberry trees

表1中，青枯菌（1）、青枯菌（2）、青枯菌（3）分別表示濃度依次是1×108個(gè)/mL、5×108個(gè)/mL、1×109個(gè)/mL的菌液。

分析表1數(shù)據(jù)可知，滅菌水的影響下，對(duì)照苗與新型苗的各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)數(shù)都相同，在引進(jìn)不同濃度的青枯菌后，對(duì)照苗的成活數(shù)為0，新型苗的最多成活數(shù)4株；對(duì)照苗的成活率為0，新型苗的成活率最低是12.6%。這是因?yàn)樾滦蜕?shù)苗里的抗菌肽有效抑制青枯菌的生長(zhǎng)，桑樹(shù)的抗病性增強(qiáng)，成活率得以提升，產(chǎn)量也會(huì)增多。

2 新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的性能分析

2.1 新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的提取

將2.1方法獲取的新型桑樹(shù)苗進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程是：液體新型樹(shù)苗培養(yǎng)基500 mL轉(zhuǎn)入1 L搖瓶?jī)?nèi)，在27℃、125 r·min-1轉(zhuǎn)速以及12%接種量的情況下，實(shí)施新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌發(fā)酵培養(yǎng)。采用布氏漏斗對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾后進(jìn)行清水沖洗，最后放到60℃烘箱烘干，提取新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉。

2.2 新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的成分分析方法

2.2.1 氨基酸成分分析方法

依次稱取新型的桑樹(shù)桑黃子發(fā)酵菌粉與原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體，通過(guò)7 mol·L-1HCl，110℃酸解22 h之后，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行試驗(yàn)[10]。

2.2.2 礦物元素分析

借鑒GB 7887-1987，采用原子吸收分光光度儀測(cè)試礦物元素。

2.2.3 pH值

用pH計(jì)測(cè)量。

2.3 氨基酸對(duì)比分析結(jié)果

原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉的氨基酸對(duì)比分析結(jié)果見(jiàn)表2。

分析表2數(shù)據(jù)可知，原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體中氨基酸總含量為9.89%，桑黃發(fā)酵菌粉中氨基酸含量為28.31%。由此可知，原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體中氨基酸雖低于新型桑黃發(fā)酵菌粉中氨基酸含量，但原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉中氨基酸種類都具有多樣化，且結(jié)構(gòu)相似，新型方法可行。

2.4 礦物元素分析結(jié)果

表3是原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉礦元素對(duì)比分析結(jié)果。

表2 原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉的氨基酸對(duì)比分析結(jié)果Tab.2 Comparative analysis of amino acids between original Phellinus igniarius fruiting body and new Phellinus igniarius fermentation powder

表3 原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體與新型桑黃發(fā)酵菌粉礦元素對(duì)比分析結(jié)果Tab.3 Comparative analysis of elements between the original Phellinus igniarius fruit body and the new type of Phellinus igniarius fermentation powder

分析表3數(shù)據(jù)可知，原始桑黃子實(shí)體和新型桑黃發(fā)酵菌粉里都具備人體必需的8種礦物質(zhì)元素。此8種礦物質(zhì)元素對(duì)造血、細(xì)胞生長(zhǎng)、酶活性激發(fā)、蛋白質(zhì)合成等都具有關(guān)鍵影響。且新型桑黃發(fā)酵菌粉里的Ca、Na、Fe、Zn、Mg含量都多于原始桑黃子實(shí)體里的含量，結(jié)構(gòu)相似，該方法可行。

2.5 最佳碳源、氮源不同含量組合對(duì)桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的影響

針對(duì)新型培養(yǎng)過(guò)程中不同碳源和氮源，對(duì)桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量的影響進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的產(chǎn)量提取合適的碳氮比，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 碳源、氮源含量對(duì)桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量的影響Tab.4 Effects of carbon and nitrogen sources on the yield of Phellinus igniarius fermentation powder

分析表4數(shù)據(jù)可知，低氮配比時(shí)，碳源含量越多，桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的產(chǎn)量越多；但高氮配比中桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量不是很客觀。低碳配比時(shí)，桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量也與氮含量的多少有關(guān)。總而言之，碳含量固定的前提下，高氮含量會(huì)干擾桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量；氮含量固定的前提下，高碳含量不會(huì)干擾桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量，但產(chǎn)量增長(zhǎng)較小。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在0.60%的氮源和4.00%的碳源條件下，桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量最多，而0.60%的氮源和3.00%的碳源條件下，桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉產(chǎn)量也很多，和最大產(chǎn)量的差距可忽視不計(jì)。所以，在節(jié)省制作成本的考慮下，最合適的碳氮含量是0.60%的氮源和3.00%的碳源。

2.6 不同起始pH值對(duì)桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的干擾

將新型培養(yǎng)的起始pH值設(shè)定5種不同程度以及1個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組是將桑黃發(fā)酵菌培養(yǎng)基導(dǎo)入自來(lái)水，衍生出自然pH值（5.91）。起始pH值試驗(yàn)培養(yǎng)設(shè)定是：溫度28℃，轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，接種量20%，260 mL三角瓶裝培養(yǎng)液110 mL，培養(yǎng)時(shí)間是8 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同起始pH值對(duì)桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的干擾結(jié)果Tab.5 Effect of different initial pH values on Phellinus igniarius Fermentation Powder

分析表5數(shù)據(jù)可知，桑黃發(fā)酵菌在弱酸性培養(yǎng)液里生產(chǎn)情況比較樂(lè)觀，但在酸性培養(yǎng)液里生長(zhǎng)較為困難；當(dāng)pH值為8.51時(shí)，桑黃發(fā)酵菌粉干重僅為0.41 g·mL-1；pH值是6.51時(shí)，桑黃發(fā)酵菌粉干重為2.55 g·mL-1，此時(shí)桑黃發(fā)酵菌粉干重最高。對(duì)照組酵菌粉pH未經(jīng)調(diào)整時(shí)，桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉干重為2.47 g·mL-1，也較高。由此可知，在新型培養(yǎng)桑黃酵菌時(shí)，可不調(diào)整pH值。分析培養(yǎng)結(jié)束的pH值可知，桑黃發(fā)酵菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較好，若所在環(huán)境存在一定不適時(shí)，自身能夠調(diào)整局部環(huán)境獲取自身所需最優(yōu)pH值。

3 結(jié)論

本文用抗菌肽基因轉(zhuǎn)化桑樹(shù)，獲取新型桑樹(shù)苗，通過(guò)測(cè)試結(jié)果驗(yàn)證新型桑樹(shù)苗抗病性較強(qiáng)，將新型桑樹(shù)苗發(fā)酵后提取新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉，與原始桑樹(shù)桑黃子實(shí)體相比，新型桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉與其結(jié)構(gòu)相似，新型桑黃發(fā)酵菌粉中的Ca、 Na、Fe、Zn、Mg含量較多，說(shuō)明桑樹(shù)桑黃發(fā)酵菌粉的新型培養(yǎng)，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)價(jià)值。為了降低成本，選用的最合理碳氮含量是0.6%的氮源和4%的碳源。桑黃發(fā)酵菌在弱酸性環(huán)境中的產(chǎn)量更高，桑黃發(fā)酵菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較好，若所在環(huán)境存在一定不適時(shí)，自身能夠調(diào)整局部環(huán)境獲取自身所需最優(yōu)pH值。

雖然桑樹(shù)基因工程的分析工作持續(xù)多年，也獲取一定成果。但是桑樹(shù)外源基因的表達(dá)轉(zhuǎn)化率低，導(dǎo)致新型植株的高效、優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)具有相應(yīng)的難度，所以，未來(lái)還需更多科技工作者深層次的去探索。