邱士偉 袁永一

中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳鼻咽喉研究所（北京100853）

V-ATP酶是真核生物細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的ATP水解驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵[1-3]，在真核生物細(xì)胞溶酶體、突觸小泡、囊泡、內(nèi)體、高爾基體等內(nèi)膜系統(tǒng)中均有分布[4]。主要通過水解ATP產(chǎn)生的能量維持氫離子轉(zhuǎn)運(yùn),從而產(chǎn)生跨膜電化學(xué)梯度并實(shí)現(xiàn)生物膜內(nèi)外PH值調(diào)節(jié)作用[5]。已有研究表明，V-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)吞、分泌蛋白存儲(chǔ)、蛋白降解[6]、胞內(nèi)膜性細(xì)胞器的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[7]、膜融合[8]、Na+吸收[9]等細(xì)胞生物學(xué)功能中扮演重要角色，進(jìn)而影響腎酸化[10]、內(nèi)分泌系統(tǒng)、男性精子的成熟[11]、破骨細(xì)胞的骨質(zhì)重吸收[12]等生理過程。目前，已報(bào)道的V-ATP酶亞基類型多達(dá)23種，不同亞基功能異常可導(dǎo)致多種疾病類型，比如ATP6V0A4、ATP6V1B1基因突變引起遠(yuǎn)端腎小管酸中毒[13]，ATP6V1C1、ATP6V1B2、ATP6V0A3[14]、ATP6V0D2[15]基因突變則導(dǎo)致骨發(fā)育及代謝方面的疾病，而ATP6V1C1在乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用[16]。最近也有研究證明ATP6V0A4[17]、ATP6V1B2[18,19]基因突變常伴隨嚴(yán)重的感音神經(jīng)性耳聾。隨著神經(jīng)生物學(xué)研究的日益深入，V-ATP酶在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中的作用也逐漸受到關(guān)注。

1 V-ATP酶基本生物學(xué)結(jié)構(gòu)

V-ATP酶屬于多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合體，共含有14個(gè)亞單元，亞單元的分子量從9kDa到100kDa不等，隨著電鏡技術(shù)的發(fā)展，V-ATP酶各亞基結(jié)構(gòu)及相互之間的空間排列關(guān)系逐漸被研究人員揭示[20]。以酵母菌為例，V-ATP酶主要含有兩個(gè)功能區(qū)域：V1部分和V0部分，V1部分為親水結(jié)構(gòu)域，暴露在細(xì)胞器膜上的胞質(zhì)中，呈球形，主要執(zhí)行催化水解ATP的功能，由A、B、C、D、E、F、G、H八個(gè)亞基組成，V1的化學(xué)計(jì)量組成為A3B3CDE3FG3H。在中心轉(zhuǎn)子的D亞基四周分布著三對(duì)A亞基和B亞基，形成一個(gè)六聚體結(jié)構(gòu)。近年來，冰凍電子顯微鏡的發(fā)展讓人們對(duì)A、B亞基的構(gòu)型有了新的認(rèn)識(shí)，每一對(duì)A、B亞基都包含一個(gè)具有催化功能的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，這三對(duì)亞基形成一個(gè)偽對(duì)稱的三聚體結(jié)構(gòu)，每對(duì)AB亞基都具有不同構(gòu)象，主要呈“緊密”“松散”和“開放”狀態(tài)，預(yù)計(jì)分別用來結(jié)合ATP、ADP和磷酸鹽[21]。在催化過程中，三對(duì)AB亞基通過構(gòu)象之間的相互轉(zhuǎn)換與中心轉(zhuǎn)子D亞基的旋轉(zhuǎn)相耦合，D亞基通過V0部分亞單元d延伸到c亞基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。A、B亞基的周圍是桿狀結(jié)構(gòu)，分別為中心桿和外圍桿，中心桿由D、F亞基組成；外圍桿由C、E、G、H亞基和V0部分a亞基的N末端組成[3]。V0部分由a、cx、cy’、cz”、d和e亞基組成，其中cx-cy’cz”屬于脂蛋白，在膜的磷脂雙分子層中共同圍成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，cy’上帶有可以結(jié)合質(zhì)子的谷氨酸殘基。d亞基扣在脂蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)的頂部，同時(shí)提供連接D亞基和F亞基的接口，使V1的中心桿與V0的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相連。a亞基與c環(huán)相連且具有兩個(gè)質(zhì)子半通道，一個(gè)朝向細(xì)胞質(zhì)，另一個(gè)朝向細(xì)胞器囊腔。當(dāng)質(zhì)子從胞質(zhì)中進(jìn)入a亞基的一個(gè)通道時(shí)，c環(huán)的谷氨酸殘基與質(zhì)子結(jié)合，V1部分AB亞基分解ATP使其構(gòu)象改變發(fā)生旋轉(zhuǎn)，通過中心桿D、F亞基連接d亞基，進(jìn)而帶動(dòng)c環(huán)的轉(zhuǎn)動(dòng)將質(zhì)子移動(dòng)到朝向細(xì)胞器囊腔的通道。此時(shí)，a亞基的一個(gè)精氨酸殘基與c環(huán)的谷氨酸殘基結(jié)合降低其pKa（酸度系數(shù)）值從而釋放質(zhì)子，最終通過另外一個(gè)通道進(jìn)入膜的另一側(cè)[22]。

圖1 V-ATP酶及其組成部分[21]V-ATP酶由V0和V1兩部分構(gòu)成，V1部分由A、B、C、D、E、F、G、H亞基組成，V0部分由a、cx、cy’、cz”、d和e亞基組成。Fig.1 V-ATPase and its componentsV-ATPase consists of V0 and V1 sectors.The V1 sector consists of A,B,C,D,E,F,G and H subunits,while the V0 sector consistsof a,cx,cy’,cz”,d and e subunits.

2 V-ATP酶在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要生物學(xué)功能

2.1 V-ATP酶維持真核細(xì)胞溶酶體系統(tǒng)的酸性環(huán)境

包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的多數(shù)真核細(xì)胞中，高酸性環(huán)境（PH=4.2-5.3）對(duì)于溶酶體中水解酶的功能至關(guān)重要，大部分溶酶體水解酶都工作在酸性環(huán)境中，但不同水解酶的最適PH值差別較大。例如，特異性組織蛋白酶D，在PH值為3.5的時(shí)候活性最佳[23,24]，而組織蛋白酶B的最適PH值為6[25]。這些最適PH值各不相同的水解酶對(duì)于溶酶體執(zhí)行各種生物學(xué)功能具有重要意義，因?yàn)榈孜飩鬟f到溶酶體內(nèi)的主要途徑依賴自噬以及內(nèi)吞作用，然而當(dāng)溶酶體與自噬體或者內(nèi)體融合時(shí)，溶酶體會(huì)出現(xiàn)重塑過程，此時(shí)將引起腔內(nèi)PH值上升，在此情況下，溶酶體仍然可以通過控制內(nèi)部相應(yīng)水解酶的表達(dá)及活化程序來協(xié)調(diào)對(duì)復(fù)雜底物的拆解和消化。上述一系列復(fù)雜反應(yīng)過程一起構(gòu)成了一個(gè)相互作用的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，稱為溶酶體系統(tǒng)[26]。

V-ATP酶主要調(diào)節(jié)細(xì)胞器內(nèi)PH環(huán)境，而整個(gè)溶酶體系統(tǒng)所對(duì)應(yīng)的酸性環(huán)境的維持與V-ATP酶功能密不可分。因此作為ATP依賴型質(zhì)子泵，V-ATP酶幾乎存在于所有真核細(xì)胞的溶酶體膜上[1]。

2.2 V-ATP酶在神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)過程中參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放

2.2.1 V-ATP酶提供電化學(xué)勢能促進(jìn)突觸囊泡膜融合及神經(jīng)遞質(zhì)釋放

神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體對(duì)生理活動(dòng)調(diào)節(jié)起主導(dǎo)作用的系統(tǒng)，其基本結(jié)構(gòu)和功能單位是神經(jīng)元，神經(jīng)元之間信息傳遞方式表現(xiàn)為突觸間神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和接受。這些高濃度的神經(jīng)遞質(zhì)主要集中于突觸小泡內(nèi)，并在接受到適當(dāng)信號(hào)刺激后開始向胞外分泌，從而實(shí)現(xiàn)不同神經(jīng)元之間的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞作用[27,28]。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，V-ATP酶所在細(xì)胞器腔內(nèi)的酸性環(huán)境與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[25]。若將帶有綠色熒光蛋白的堿性磷酸酶標(biāo)記到液泡(包括突觸小泡在內(nèi)的不同囊泡型細(xì)胞器)，觀察液泡活動(dòng)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)液泡腔內(nèi)的酸性環(huán)境有利于液泡之間膜融合[29]。突觸囊泡與突觸前膜的融合是一個(gè)高度復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，囊泡脂質(zhì)雙分子層與突觸前膜之間首先形成一個(gè)融合孔，融合孔逐漸打開到完全擴(kuò)展，最終釋放神經(jīng)遞質(zhì)。形成融合孔的機(jī)制迄今仍不明確，目前有兩種推測：1.V-ATP酶V0區(qū)域間接參與調(diào)控，促進(jìn)囊泡脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜脂質(zhì)部分融合形成融合孔[30]；2.V-ATP酶V0區(qū)域亞基中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜脂質(zhì)部分融合進(jìn)而出現(xiàn)融合孔[31]。V0區(qū)域a亞基具有四種不同亞型（a1-a4），每種亞型分布在特定的組織細(xì)胞內(nèi)。表達(dá)a1亞型的基因可通過可變剪切產(chǎn)生四種不同的轉(zhuǎn)錄本，其中一種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)a1-I蛋白，主要分布于神經(jīng)末梢區(qū)域。為了觀察a1-I蛋白的功能，Nicolas Morel等人采用光滅活實(shí)驗(yàn)，即在不影響蛋白功能情況下通過基因修飾的方式在目的蛋白中插入四環(huán)素，四環(huán)素可以特異地結(jié)合一種膜滲透性雙砷染料。光源照射后，染料會(huì)短暫釋放活性氧，使標(biāo)記了四環(huán)素的蛋白瞬間滅活。通過光滅活實(shí)驗(yàn)使a1-I蛋白失活后，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量迅速下降。然而，當(dāng)使a1-I蛋白失活的同時(shí)增加突觸囊泡內(nèi)PH值，神經(jīng)遞質(zhì)的下降程度并無明顯差別。當(dāng)僅僅改變突觸囊泡內(nèi)PH值，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量隨PH值升高而降低。最終證明，V-ATP酶的V0區(qū)域可作為PH感受器參與調(diào)控突觸囊泡的膜融合[32]。

2.2.2 V-ATP酶感應(yīng)Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)的突觸囊泡膜融合及神經(jīng)遞質(zhì)釋放

眾所周知，Ca2+又被稱為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，其濃度變化可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，而這種調(diào)節(jié)作用主要通過結(jié)合Ca2+的鈣調(diào)蛋白實(shí)現(xiàn)。突觸小泡神經(jīng)遞質(zhì)的釋放分為誘發(fā)釋放和自發(fā)釋放，誘發(fā)釋放發(fā)生在動(dòng)作電位（或一系列動(dòng)作電位）之后，而自發(fā)釋放則在缺乏突觸前動(dòng)作電位的情況下發(fā)生。這兩種形式的釋放都需要Ca2+參與，較高Ca2+濃度是引發(fā)膜融合過程的前提條件。誘發(fā)釋放形式下產(chǎn)生的較高Ca2+濃度主要與神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)作電位傳遞到突觸前末梢、觸發(fā)前膜中Ca2+電壓門控通道、通道開放后Ca2+順濃度差流入囊泡融合位點(diǎn)附近有關(guān)。而自發(fā)釋放形式下Ca2+是如何產(chǎn)生的仍不明了[33]。

執(zhí)行膜融合這一功能的主要蛋白被稱為SNARE(可溶性NSF附著受體)家族蛋白。SNARE家族蛋白又可細(xì)分為R-SNARE（位于突觸囊泡中）和Q-SNARE（位于質(zhì)膜上），R-SNARE與Q-SNARE結(jié)合，組成SNARE復(fù)合體，進(jìn)而介導(dǎo)膜融合過程，最終釋放神經(jīng)遞質(zhì)[34]。

正常情況下，沒有結(jié)合Ca2+的鈣調(diào)蛋白不與V-ATP酶V0區(qū)域a亞基發(fā)生結(jié)合。當(dāng)Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后，鈣調(diào)蛋白便與a亞基相互作用形成一個(gè)緊密蛋白復(fù)合物。除此之外，V0區(qū)域還與R-SNARE和Q-SNARE發(fā)生相互作用[35]，Syntaxin1A和SNAP-25為Q-SNARE組成部分，V-ATP酶V0區(qū)域通過與Syntaxin1A和SNAP-25競爭性結(jié)合，破壞SNARE復(fù)合物形成。而結(jié)合了Ca2+的鈣調(diào)蛋白可以干擾V0與Syntaxin1A和SNAP-25之間的競爭性結(jié)合，促進(jìn)Q-SNAREs復(fù)合體形成，并結(jié)合R-SNARE催化融合。由此證明，V0與鈣調(diào)蛋白一起，共同參與膜融合過程[36]。

圖2 V-ATP酶V0部分參與突觸囊泡與突觸前膜之間的膜融合[36]。當(dāng)沒有鈣調(diào)蛋白參與時(shí)，V0部分的a亞基通過與Q-SNARE競爭性結(jié)合破壞Q-SNARE和R-SNARE之間形成復(fù)合物影響膜融合，結(jié)合了Ca2+的鈣調(diào)蛋白可以通過與V0部分的a亞基結(jié)合進(jìn)而使Q-SNARE從V0部分解離與R-SNARE結(jié)合形成SNARE復(fù)合物介導(dǎo)膜融合過程。Fig.2 The V0 sector of V-ATPase is involved in membrane fusion between synaptic vesicles and presynaptic membranes When no calmodulin is involved,subunit a of domain V0 disrupts the assembly of Q-SNARE and R-SNARE by competitively binding to Q-SNARE.Ca2+-calmodulin can disrupt the competitive interactions of V 0 with the SNAREs,perm it the Q-SNAREs to form a complex,and also incorporate the R-SNARE and catalyze fusion.

3 展望

隨著對(duì)V-ATP酶結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識(shí)的加深，對(duì)其引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理機(jī)制的探索逐漸展開。目前，V-ATP酶與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的系統(tǒng)性報(bào)道相對(duì)較少，未來有望通過形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等多種手段對(duì)V-ATP酶缺陷導(dǎo)致認(rèn)知和記憶障礙的致病機(jī)制進(jìn)行全面闡釋。