楊媛媛胡洪義 陳偉 冀飛 李小玲鐘家滔 琚良艷丁楚楚陶源*

1北京大學深圳醫(yī)院耳鼻咽喉科（深圳518036）

2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科；解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所，耳鼻咽喉頭頸外科國家臨床研究中心，聾病教育部重點實驗室，聾病防治北京市重點實驗室，軍事聲損傷防護實驗室，老年共病國家臨床研究中心（北京100853）

3中山大學附屬第八醫(yī)院心血管內(nèi)科（深圳518036）

噪聲習服（Sound conditoning，SC）是由 Canlon發(fā)現(xiàn)并提出[1]。即在給動物高強度噪聲暴露之前，給予中等水平的長期的聲音刺激，可減少隨后高強度噪聲所致暫時性閾移及永久性閾移。急性聲損傷易引起噪聲性耳聾，噪聲習服對急性聲損傷存在著聽力保護作用，但目前具體的機制不明。本文研究噪聲習服對急性聲損傷是否存在聽力保護作用，計數(shù)突觸數(shù)目的變化，耳蝸內(nèi)氧自由基丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量與抗氧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活力，初步探討其對急性聲損傷具有聽力保護功能的可能機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

2-3月齡SPF級標準的健康白毛雌性豚鼠40只，體重250-300g，耳廓反射正常，由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供，研究符合解放軍總醫(yī)院倫理委員會相關(guān)動物試驗相關(guān)規(guī)定。隨機分為4組，每組10只豚鼠，對照組（Control）為空白對照組，另3組為實驗組，具體為：習服噪聲組（Sound condtionging,SC），連續(xù)7天予以85dB白噪聲暴露，每天持續(xù)3小時；噪聲暴露組（Noise exposure,NE），連續(xù)3天予以105dB白噪聲暴露，每天持續(xù)3小時；習服噪聲后噪聲暴露組（SC+NE），連續(xù)7天予以85dB白噪聲暴露，每天持續(xù)3小時，休息24小時后，再連續(xù)3天105dB白噪聲暴露，每天持續(xù)3小時。

1.2 噪聲暴露

標準聲級計對聲音進行校準后，按照分組，分別對3組豚鼠行噪聲暴露。暴露時將豚鼠置于鼠籠中，鼠籠空間盡可能狹小，揚聲器置于鼠籠之上。

1.3 ABR閾值測定

采用美國TDT測聽設(shè)備（TDT,Alachua,Florida,美國）和Biosig測聽軟件進行ABR測試。測聽在隔聲屏蔽室內(nèi)進行，測聽前使用1%戊巴比妥(40 ml/kg,腹腔注射)對豚鼠進行麻醉。記錄電極置于兩側(cè)耳廓前緣連線中點皮下，參考電極置于右耳耳后皮下，接地電極置于對側(cè)耳耳后皮下。發(fā)聲揚聲器距外耳道口約0.5cm。實驗采用短聲(Click)和4k、8k、16k、24k、32k Hz短純音(Tone burst，上升/下降時間1 ms，平臺4 ms)作為刺激聲，帶通濾波為300～3000Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時間10ms。刺激聲強度自最大刺激強度（90 dB SPL）開始，以10 dB為步距逐漸遞減，直至檢測不出重復的ABR波形，再向上遞增5 dB，直至能檢測出重復的ABR波形，以能分辨出可重復的ABR波Ⅲ的最低刺激強度判斷閾值。分別于噪聲暴露前24小時及暴露后即刻（1-3小時內(nèi)）完成右耳ABR閾值測定。

1.4 耳蝸基底膜取材

各組分別取5只豚鼠，ABR測聽完成后斷頭，去除腦組織，分離顳骨與聽泡,去除聽泡骨質(zhì)，取出耳蝸，將耳蝸置入4%多聚甲醛的培養(yǎng)皿中。在顯微鏡下使用顯微鑷戳破蝸頂，前庭窗和蝸窗，灌注多聚甲醛，4°C冰箱過夜。第二天置于PBS培養(yǎng)皿中，緩慢剝?nèi)ノ仛?，螺旋韌帶、前庭膜及蓋膜，分離蝸軸和基底膜，按頂、第3、第2、底回分為4段。

1.5 免疫熒光及染色

0.5%Triton100-X打孔30min，含有PBS緩沖液的5%的山羊血清封閉1小時，漂洗充分后加入一抗（小鼠來源CtBP2，1:200,abcam;兔來源Myosin VIIA,1:200,abcam）后4°C孵育一晚上，次日用PBS漂洗3遍，每次5min，隨后加入二抗（羊抗小鼠647抗體1:200、羊抗兔488抗體1:200），毛細胞的纖毛染色染色（anti-phalloidin），直接加入phalloidin 555(1:1000，thermo)室溫避光孵育1h，隨后漂洗3次每次5min，用含DAPI的封片劑封片避光保存。

1.6 共聚焦顯微鏡

使用Leica正置共聚焦顯微鏡（TCSSP5 II;Leica Microsystems,Wetzlar,Germany），20倍鏡下，選擇405nm、488nm及555nm波長的激發(fā)光對標本進行層掃，層厚1um/層，熒光激發(fā)下分別顯示藍色、紫色和紅色。以信號出現(xiàn)時開始層掃，以信號消失時結(jié)束，將所有圖片疊加后形成最終的結(jié)果圖片。切換至63倍油鏡，選擇405nm、488nm及647nm波長的激發(fā)光對標本進行層掃，層厚0.35um/層，熒光激發(fā)下分別顯示藍色、紫色和綠色。以信號出現(xiàn)時開始層掃，以信號消失時結(jié)束，將所有圖片疊加后形成最終的結(jié)果圖片。

1.7 突觸前膜計數(shù)

在激光共聚焦顯微鏡下（63X），在頂、第3、第2、底回分別以10個內(nèi)毛細胞核為一個計數(shù)矩形視野，每個視野中將突觸前膜標記信號選中（CtBP2，綠色），總數(shù)計數(shù)，除以10，得到每個內(nèi)毛細胞平均突觸標記物數(shù)量，每個標本每回隨機選取3個視野，共計3個標本（4回，每回9個視野，共36個視野），最后統(tǒng)計出每組動物突觸前膜的數(shù)量（均數(shù)±標準差）。

1.8 耳蝸組織MDA含量和SOD活力測定

每組5只豚鼠處死后快速斷頭,取下雙側(cè)聽泡，分別制備10%組織勻漿，每個勻漿組織分別測試MDA含量及SOD活力（每組10個樣本），均按照南京建成生物工程研究所試劑盒步驟進行。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25進行統(tǒng)計分析。分別對4組的ABR閾值、突觸計數(shù)、MDA含量及SOD活力行正態(tài)性檢驗，采用單因素方差分析，各組組間比較采用LSD法檢驗。P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 ABR閾值檢測

分析 Control、SC、NE、SC+NE 各頻率（Click、Tb4k、Tb8k、Tb16k、Tb24k、Tb32k Hz）的 ABR閾值（dB SPL，表1），單因素方差分析，LSD法檢驗各組各頻率的閾值差異。NE各頻率的ABR閾值最高，SC+NE各頻率閾值明顯低于NE，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。同時，SC+NE各頻率的ABR閾值明顯高于Control，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖1）。

表1 實驗組與對照組的ABR閾值變化（dBSPL，x±s，n=10）Table 1 The ABR threshold of the experiment groups and control group（dB SPL，x±s，n=10）

圖1 實驗組與對照組的ABR閾值變化Fig.1 The ABR threshold of the experiment groups and control groupSC+NE各頻率的ABR閾值明顯低于NE，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。SC+NE各頻率的ABR閾值明顯高于Control，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。**表示P＜0.01。SC+NE was significantly reduced in the ABR thresholds across frequencies compared with NE（P＜0.01）;Control was significantly reduced in the ABR thresholds across frequenciescompared with SC+NE（P＜0.01）.**indicates P＜0.01.

2.2 突觸前膜計數(shù)

通過免疫標記內(nèi)外毛細胞核（DAPI，藍色）及突觸前膜（CtBP2，綠色），分別計數(shù)每組3個標本的頂、第3、第2及底回突觸前數(shù)量變化，分析4組之間的差異。各組各回的外毛細胞，均未見外毛細胞缺失。CtBP2特異性標記標記突觸前膜，分別計數(shù)Control,SC,NE,SC+NE每個內(nèi)毛細胞CtBP2數(shù)量（/IHC,x±s）。頂回分別為 11.80±0.59,11.29±0.29,8.87±0.30C,10.93±0.65；第3回分別為12.27±0.35，11.39±0.55,9.69±0.42，11.03±0.38；第 2回分別為13.67±0.43,11.85±0.51,7.03±0.30，12.46±0.56；底回分別為 21.39±1.35，14.18±0.40,7.47±0.67,12.68±1.32。單因素方差分析，LSD法檢驗組間的差異，Control每回的單個內(nèi)毛細胞突觸前膜數(shù)目均多于SC+NE，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；NE每回單個內(nèi)毛細胞的突觸前膜數(shù)量均少于SC+NE，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；SC頂回及第3回單個內(nèi)毛細胞突觸前膜計數(shù)與SC+NE相比，無統(tǒng)計學差異（PApical=0.13，P3rd=0.91，P＞0.05），但第2回單個內(nèi)毛細胞突觸前膜計數(shù)，SC少于SC+NE，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；底回單個內(nèi)毛細胞突觸前膜計數(shù)，SC多于SC+NE，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 耳蝸組織MDA含量及SOD活力測定

對照組，習服噪聲組，噪聲組，習服噪聲后噪聲組，MDA 含量（nmol/mgprot,x±s,n=10）分別為：2.01±0.78,2.43±1.19,3.52±0.82,2.39±1.31。SOD活力（U/mgprot,x±s,n=10）分別為：101.05±13.29,108.37±33.82,68.00±15.06,94.52±18.16。噪聲組MDA含量最高，SOD活性最低，單因素方差分析，LSD法檢驗各組之間的差異。習服后噪聲組與噪聲組相比，MDA含量低于噪聲組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SOD活力高于噪聲組，差異有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。但與正常組及習服噪聲組相比，MDA含量及SOD活力均無明顯統(tǒng)計學差異。

3 討論

噪聲習服，是指先給予一定時間的中等強度噪聲，能保護耳蝸免受更高強度噪聲造成的損傷[1]，最早由Canlon 等報道，在沙鼠[2]、大鼠[3]、小鼠[4]、豚鼠[5]、兔子[6]以及人類[7]都發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象。隨后Roy S等和Suryadevara AC等報道，噪聲習服（2小時90dB SPL寬頻噪聲）能保護鉑類及氨基糖苷類對小鼠耳蝸毛細胞的損傷[2,4]。本實驗，是先給中等強度的習服噪聲，再給高強度的噪聲，發(fā)現(xiàn)了噪聲習服對更高強度的噪聲有著聽力保護作用，也驗證了噪聲習服這種現(xiàn)象的存在。關(guān)于噪聲習服對聽力的保護作用機理，目前尚不明確。有觀點認為可能是通過上調(diào)熱休克蛋白（HSPs）的表達而發(fā)揮保護作用（如HSP32，HSP70），減少毛細胞的損傷[4]；也有觀點認為是通過激活下丘腦-垂體-腎上腺軸[2]，從而增加糖皮質(zhì)激素的釋放而發(fā)揮保護作用；Mohammadkhani G等認為是通過增加抗氧化酶而發(fā)揮作用[8]。Maison SF等則認為可能是噪聲習服影響了外橄欖核，從而導致耳蝸神經(jīng)纖維活性改變而發(fā)揮聽力保護作用[9]。

本實驗中，予以白噪聲85dB或105dB噪聲暴露，未發(fā)現(xiàn)其內(nèi)外毛細胞有明顯損傷，Chuang S等也得出了類似的研究結(jié)果[10]。突觸位于內(nèi)毛細胞與I型螺旋神經(jīng)節(jié)之間。對噪聲敏感，突觸損害是噪聲性感音神經(jīng)性聾的基礎(chǔ)。噪聲能導致突觸損傷，表現(xiàn)為不同程度的末端腫脹，導致了內(nèi)毛細胞與螺旋神經(jīng)節(jié)之間的連接被破壞[11]。突觸可能是哺乳動物最易受噪聲影響的。噪聲習服對強噪聲的聽力保護作用，是否與突觸的損傷有關(guān)，本實驗中發(fā)現(xiàn)，噪聲習服組、噪聲組、噪聲習服+噪聲組的突觸數(shù)目均比對照組減少，噪聲組突觸數(shù)目最少，損傷最大，耳蝸基底膜的第2回及底回表現(xiàn)最明顯；噪聲習服+噪聲組的突觸數(shù)目明顯比噪聲組多，且與正常對照組相比，頂回及第3回的突觸數(shù)目基本接近于對照組。Ke L[12]等認為突觸的數(shù)目改變及重新分布可能會導致聽力的改變。Kujawa SG與Liberman MC報道CBA小鼠噪聲暴露（100dB SPL 8-16k倍頻噪聲2h）后1天突觸減少至40%,但未引起永久性閾移[13]，于2015年再次報道噪聲引起了耳蝸內(nèi)突觸數(shù)目的減少[14]。Liu L等研究發(fā)現(xiàn)豚鼠噪聲暴露后1天，突觸數(shù)量減少，體積稍變大，位置更靠近內(nèi)毛細胞，平均減少約40%[15,16]，且底回突觸損傷的最多[15]。這與我們得出的結(jié)果類似，我們推測，噪聲習服可能通過對突觸的保護發(fā)揮聽力保護的作用。

正常情況下，機體通過抗氧化劑、抗氧化酶系統(tǒng)消除氧自由基，使機體活性氧的氧化與抗氧化防御系統(tǒng)保持平衡，強噪聲暴露后，平衡被打破，激發(fā)細胞凋亡，聽力損失[17]。有學者認為，噪聲習服對聽力的保護作用，是通過恢復這種抗氧化平衡而發(fā)揮作用[18,19]。有研究報道，抗氧化劑藥物對保護或治療噪聲性耳聾有效果[20,21]。噪聲習服能增加抗氧化酶的有效性，從而保護噪聲對耳蝸造成的氧化損傷[8,18]。MDA含量是細胞內(nèi)氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，組織內(nèi)MDA含量是細胞活性氧堆積水平和細胞損傷程度的重要指標[21]。SOD是一種抗氧化酶，清除氧自由基，組織內(nèi)SOD活力能間接反映機體的抗氧化防御系統(tǒng)功能[22]。本實驗檢測耳蝸內(nèi)MDA含量及SOD活力，了解噪聲習服對聽力的保護作用，是否通過恢復這種氧化與抗氧化平衡而發(fā)揮作用。噪聲組的MDA含量最高，SOD活力最低，習服噪聲組與正常對照組相比，MDA含量稍高，而SOD活力稍低。習服噪聲后噪聲組與噪聲組相比，MDA含量明顯減低，而SOD活力明顯增高，我們推測噪聲習服可能通過恢復氧化與抗氧化的平衡而發(fā)揮聽力保護的功能。

本實驗驗證了噪聲習服對豚鼠急性聲損傷的聽力保護作用，初步探索了其發(fā)揮聽力保護作用的機制，可能是通過減少噪聲對突觸的損傷及恢復耳蝸組織內(nèi)氧化與抗氧化平衡而發(fā)揮作用。