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        新型香菇母種培養(yǎng)基的篩選

        2019-08-10 04:20:00楊煥玲查磊趙妍黃建春雋加香陳明杰
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年3期
        關(guān)鍵詞:母種蒸餾水海藻

        楊煥玲 查磊 趙妍 黃建春 雋加香 陳明杰

        摘要:以香菇菌株18為材料,通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)基的香菇菌絲生長(zhǎng)狀況的評(píng)價(jià)、菌絲生長(zhǎng)速度及生物量的分析,以篩選出新型的香菇母種培養(yǎng)基。結(jié)果表明,與基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基相比,添加海藻糖的新型培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲的生長(zhǎng)具有一定的積極作用,能夠促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)速度,有助于菌絲生物量的增加,但不改變其蛋白質(zhì)組成。綜合來(lái)看,PDTA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,瓊脂15 g,葡萄糖10 g,海藻糖10 g,蒸餾水1 000 mL)、PTA-2培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,瓊脂15 g,海藻糖20 g,蒸餾水1 000 mL)更適合香菇18菌絲的培養(yǎng)。

        關(guān)鍵詞:香菇;培養(yǎng)基;生長(zhǎng)速度;生物量;SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)

        中圖分類號(hào): S646.1+20.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A? 文章編號(hào):1002-1302(2019)03-0124-03

        香菇(Lentinula edodes)在分類學(xué)上屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota) 、傘菌綱(Agaricomycetes) 、傘菌目(Agaricales) 、光茸菌科(Omphalotaceae)、香菇屬(Lentinula)(Available online:http://www.mycobank.org/)。香菇味道鮮美,肉質(zhì)細(xì)嫩,具有獨(dú)特的香氣和豐富的營(yíng)養(yǎng),含有較高的蛋白質(zhì)、維生素以及多種類型的礦質(zhì)元素,有著山珍、菇中之王等美稱[1-2]。香菇具有延緩衰老、防癌抗癌、降血脂血壓及膽固醇、提高機(jī)體免疫功能等作用[3],因此香菇具有很高的食用價(jià)值,市場(chǎng)廣闊,是世界上第二大食用菌,提高其產(chǎn)量及品質(zhì)具有重要意義[4]。

        食用菌的培養(yǎng)基是保藏菌種的關(guān)鍵,同時(shí)也是生產(chǎn)上獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要前提[5-6]。目前,香菇常使用的固體培養(yǎng)基主要為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)[7],同時(shí)也存在其他少數(shù)類型的培養(yǎng)基,例如用農(nóng)副產(chǎn)品或金銀花藤浸出液制作的香菇母種培養(yǎng)基[8-9],富硒香菇液體培養(yǎng)基[10-11],產(chǎn)多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)基[12],碳源、氮源等優(yōu)化的香菇培養(yǎng)基[13-14]等。海藻糖是一種非還原性二糖,廣泛存在于各種生物體內(nèi),能夠增強(qiáng)生物體對(duì)高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒試劑等逆境的抵抗能力[15]。通過(guò)外源添加的方式,海藻糖在菌體外部形成保護(hù)膜,能起到較好的非特異性保護(hù)細(xì)胞,使生物膜和蛋白質(zhì)等在不良環(huán)境中免受傷害,并且使菌體不受自身代謝產(chǎn)物影響的作用[16-17]。本試驗(yàn)采用添加海藻糖的培養(yǎng)基,對(duì)香菇18菌株進(jìn)行培養(yǎng),將它與常用的基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基進(jìn)行比較,篩選最佳培養(yǎng)基,不僅豐富了生產(chǎn)上的培養(yǎng)基種類,也在菌種保藏、交替使用培養(yǎng)基防止菌種退化及菌種抗逆等方面具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 供試菌株

        香菇菌株18由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

        1.2 培養(yǎng)基種類

        PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,瓊脂15 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1 000 mL。

        PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蒸餾水 1 000 mL。

        PDTA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,瓊脂15 g,葡萄糖10 g,海藻糖10 g,蒸餾水1 000 mL。

        PDTA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖10 g,海藻糖 10 g,蒸餾水1 000 mL。

        PTA-2固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,瓊脂15 g,海藻糖 20 g,蒸餾水1 000 mL。

        PTA-2液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,海藻糖20 g,蒸餾水 1 000 mL。

        PTA-5固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,瓊脂15 g,海藻糖 50 g,蒸餾水1 000 mL。

        PTA-5液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,海藻糖50 g,蒸餾水 1 000 mL。

        1.3 固體及液體培養(yǎng)方法

        所有培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min,冷卻后待接種。在紫外線滅菌30 min后的超凈工作臺(tái)上,選用相同生長(zhǎng)狀況的香菇菌絲進(jìn)行接種。固體培養(yǎng)在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng),液體培養(yǎng)在25 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的恒溫?fù)u床中黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

        1.4 香菇菌絲生長(zhǎng)情況及蛋白組成的測(cè)定

        1.4.1 菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)及生長(zhǎng)速度的測(cè)定 在長(zhǎng)滿菌絲的PDA固體培養(yǎng)基上,分別用直徑為5 mm的打孔器沿菌落邊緣打孔,將菌塊接種于不同類型的固體培養(yǎng)基上,在25 ℃黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng),每天定時(shí)觀察菌絲的生長(zhǎng)形態(tài)[18]。分別在接種后培養(yǎng)4、6、8 d用十字交叉法測(cè)量菌落半徑,菌落半徑差值(mm)與生長(zhǎng)時(shí)間(d)的比值即為菌絲生長(zhǎng)速度(mm/d)。每組重復(fù)3次,計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度并且在培養(yǎng)10 d時(shí)對(duì)菌絲菌落形態(tài)進(jìn)行拍照。

        1.4.2 菌絲生物量的測(cè)定 接種后的液體培養(yǎng)基在25 ℃恒溫?fù)u床中黑暗條件下培養(yǎng)到10 d時(shí),菌絲基本長(zhǎng)滿搖瓶,處于生長(zhǎng)旺盛階段,10 d時(shí)收集香菇菌絲。用烘干至恒質(zhì)量(m1)的濾紙過(guò)濾,將菌絲體與濾紙共同烘干至恒質(zhì)量(m2),計(jì)算菌絲體干質(zhì)量m=m2-m1,每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

        1.4.3 SDS-PAGE電泳分析 將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d的菌絲進(jìn)行收集,采用TCA(三氯乙酸)/丙酮法提取蛋白質(zhì),并用濃度為12.5%的凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白質(zhì)組成。

        2 結(jié)果與分析

        2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)狀況的影響? 將接種后的培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng),分別在接種后4、6、8、10 d比較觀察菌絲生長(zhǎng)狀態(tài),記錄菌絲色澤、邊緣整齊度以及菌落長(zhǎng)勢(shì),并劃分如下長(zhǎng)勢(shì)等級(jí):菌絲潔白粗壯,菌落濃密,菌絲分支多且密,長(zhǎng)勢(shì)好,邊緣整齊則標(biāo)記為+ + +;菌絲中等粗壯,菌落濃密,微黃,菌絲分支中等,邊緣較整齊記為+ +;菌絲纖細(xì)絨毛狀,微黃至黃褐色,菌落稀疏,邊緣不整齊則記為+[19]。

        香菇在4種培養(yǎng)基上10 d的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖1,菌絲生長(zhǎng)狀況評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。香菇菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況良好,菌絲潔白微黃,菌落較稀疏,菌絲中等粗壯且分支中等,邊緣整齊;在PDTA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好,菌絲潔白微黃,菌絲中等粗壯且菌落較濃密,菌落邊緣整齊;在PTA-2培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最好,菌絲潔白粗壯,菌落濃密,菌絲分支多且密,邊緣整齊;在PTA-5培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好,菌絲潔白微黃,菌落較濃密,菌絲分叉多,邊緣整齊。

        2.1.2 不同培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)速度的影響 香菇在不同的培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定結(jié)果(圖2)表明,添加海藻糖的培養(yǎng)基對(duì)菌絲的生長(zhǎng)速度具有不同程度的提高作用。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基PDA為對(duì)照,添加海藻糖的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度與對(duì)照具有顯著性差異,其中PDTA培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度與對(duì)照具有極顯著性差異。

        2.1.3 不同培養(yǎng)基對(duì)香菇菌絲生物量的影響 香菇在不同液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌絲生物量測(cè)定結(jié)果(圖3)表明,添加海藻糖的培養(yǎng)基對(duì)菌絲生物量具有不同程度的提高作用。與對(duì)照相比,香菇在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的生物量均有一定程

        度提高,但均未達(dá)到顯著性差異。

        2.1.4 SDS-PAGE電泳 收集不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的香菇菌絲,采用TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果(圖4)表明,新培養(yǎng)基的菌絲蛋白質(zhì)條帶組成與基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲蛋白質(zhì)條帶組成無(wú)區(qū)別, 說(shuō)明添加海藻糖的培養(yǎng)基并不會(huì)改變香菇菌絲的蛋白質(zhì)組成。

        3 討論與結(jié)論

        香菇新型母種培養(yǎng)基的篩選對(duì)香菇菌種的保藏以及生產(chǎn)上高產(chǎn)的穩(wěn)定性具有重要影響。添加海藻糖的培養(yǎng)基能為香菇菌絲生長(zhǎng)提供良好的營(yíng)養(yǎng)和空間環(huán)境,且制作方法簡(jiǎn)單,能夠顯著加快菌絲的生長(zhǎng),一定程度上提高菌絲生物量,具有間接增加經(jīng)濟(jì)效益的潛力。海藻糖作為一種穩(wěn)定的非還原性二糖,具有防止蛋白質(zhì)變性[20]的作用,而且積累到一定的水平,會(huì)響應(yīng)于高溫[21-22]、碳和氮饑餓[23-25]、氧自由基[26]、脫水[27-28]、冷脅迫[29]、冷凍[28]、甲苯及乙醇[30] 等引發(fā)的脅迫性應(yīng)激[20,31-32]。添加海藻糖培養(yǎng)基的使用,不但能夠?yàn)橄愎骄z提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,而且有助于增強(qiáng)香菇菌絲在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)對(duì)脅迫條件的能力。試驗(yàn)以普通PDA培養(yǎng)基為對(duì)照,對(duì)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的香菇菌絲生長(zhǎng)狀況進(jìn)行評(píng)價(jià),對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度及生物量進(jìn)行分析,結(jié)果表明,香菇菌絲較適合在PDTA培養(yǎng)基、PTA-2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。綜上,本試驗(yàn)中香菇新型母種培養(yǎng)基可以為深入開(kāi)展食用菌菌種保藏技術(shù)提供參考,同時(shí)也揭示了外源添加海藻糖的培養(yǎng)基具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。

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