齊 越 鄢長(zhǎng)余 矯 建 趙月然▲

1.徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校藥學(xué)技術(shù)系，江蘇徐州 221116；2.大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116021

生物胺是一類具有生物活性、含氨基的低分子質(zhì)量化合物，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，常見(jiàn)的生物胺類化合物有組胺、色胺、腐胺、尸胺、精胺、亞精胺及酪胺等。研究發(fā)現(xiàn)，攝入適量的生物胺具有促進(jìn)動(dòng)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)代謝活力、增強(qiáng)免疫力和清除自由基的作用，但是生物胺的過(guò)量攝入則可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害，如頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉、心悸及呼吸紊亂等過(guò)敏反應(yīng)，甚至危及生命[1-3]。生物胺常被看作是代表產(chǎn)品質(zhì)量和安全的標(biāo)志[4-7]。因此，建立靈敏便捷的生物胺檢測(cè)技術(shù)對(duì)人體健康風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警和防范十分必要，尤其對(duì)于中藥注射劑（traditional chinese medicine injection，TCMI）中生物胺的安全評(píng)估具有非常重要的意義。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-16]，中藥對(duì)生物胺的相關(guān)研究主要集中在中藥材，對(duì)TCMI的研究幾乎空白，因此本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-18]，建立了采用液質(zhì)聯(lián)用同時(shí)測(cè)定TCMI中5種生物胺含量的檢測(cè)方法，對(duì)TCMI的安全性監(jiān)測(cè)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290/Agilent 6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，配有QQQ Quantitative Analysis工作站和Quantitative Analysis B.05.00工作站（Agilent公司）；BP211D型和LE244S型電子天平（satorius公司）。

1.2 試藥

組胺（批號(hào)：BCCD9621，純度100.0%）、腐胺（批號(hào)：BCCG9566，純度100.0 %）、酪胺（批號(hào)：BCCG2965純度，99.3%）、色胺（批號(hào)：BCCF9479，純度99.2%）、亞精胺（批號(hào)：BCCF5855純度99.7%）5種對(duì)照品均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲酸、甲酸銨為色譜純，水為超純水。收集中藥注射液樣品9批次，見(jiàn)表1。

表1 9批中藥注射液樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEHHILIC 柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相，A：20 mmol/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH為4.0），B：乙腈，梯度洗脫程序：0～2 min，90%～80% A，2～5 min，80%～75%A，5～6 min，75%～40%A，6～9 min，40% A，9～12 min，40%～90% A。流速：0.3 ml/min,溫度：40℃，進(jìn)樣量1 μl。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，正離子掃描方式（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；噴霧壓力45 psi；干燥氣流速6 L/min；毛細(xì)管電壓3500 V；干燥氣溫度350℃。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 5種化學(xué)成分的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取組胺5.10 mg、腐胺6.01 mg、酪胺6.05 mg、色胺7.50 mg、亞精胺5.99 mg，分別置20 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻；再分別精密量取1 ml，置20 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。5種生物胺對(duì)照品提取的MRM質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 5種生物胺對(duì)照品提取的MRM質(zhì)譜圖

2.2.2 供試品溶液 精密量取疏血通注射液供試品（樣品9）5 ml，置10 ml量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。疏血通注射液供試品（樣品9）提取的MRM質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 疏血通注射液供試品(樣品9）提取的MRM質(zhì)譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍 分別精密稱取5種對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1、5、10、20、50、100 ng的混合溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度X（ng/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系

2.3.2 檢出限與定量限 以信噪比3（S/N）為方法的檢出限，信噪比10（S/N）為方法的定量限，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出組胺、腐胺、酪胺、色胺、亞精胺五種生物胺的檢出限分別為1.0、2.0、1.5、3.0和2.0 μg/L，定量限分別為3.0、6.0、5.0、6.0和5.0 μg/L。

2.3.3 加樣回收率 精密稱取組胺、腐胺、酪胺、色胺、亞精胺對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含10 ng的混合溶液，作為回收率試驗(yàn)的加標(biāo)溶液。取已知含量的樣品9份，分別每3份加入上述對(duì)照品加標(biāo)溶液1.0、2.0、3.0 ml，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率?；厥章试?3.5%～98.2%，RSD均在1.0%以內(nèi)，見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3 樣品的測(cè)定結(jié)果

取10批注射液樣品各2份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積以并計(jì)算含量。血栓通注射液（151003）和醒腦靜注射液中五種生物胺均未檢測(cè)到，疏血通注射液中腐胺、酪胺及亞精胺含量較高。見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/ml）

3 討論

隨著中藥注射劑在臨床的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)的發(fā)生率逐漸增多，而過(guò)敏反應(yīng)主要是由生物胺類物質(zhì)引起的。組胺是常見(jiàn)的生物胺，其主要的表現(xiàn)為外周阻力降低，血壓快速下降[19-20]；酪胺、色胺能夠刺激血管平滑肌，使血壓上升[21]；腐胺是亞精胺的前體，可減少組胺代謝，增強(qiáng)毒性[22]。

本試驗(yàn)建立了一種在正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下快速測(cè)定中藥注射液中5種生物胺的UPLC-MS/MS測(cè)定方法。流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L甲酸銨，梯度洗脫，流速0.3 ml/min。采用強(qiáng)極性色譜柱HILIC柱，樣品無(wú)需前處理。結(jié)果顯示組胺、腐胺、酪胺、色胺、亞精胺出峰時(shí)間短，分離效果較好，梯度洗脫可以兼顧以上5種生物胺的保留行為，對(duì)照品及供試品中生物胺的質(zhì)譜相應(yīng)值較好。

本試驗(yàn)考察了丹磺酰氯衍生化和直接稀釋兩種樣品前處理方法。生物胺衍生化操作復(fù)雜，對(duì)照品及樣品均需柱前衍生化操作，試驗(yàn)重復(fù)性較差，且丹磺酰氯毒性較大，試驗(yàn)危險(xiǎn)性較高。故本試驗(yàn)采用直接稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

由于生物胺的極性比較強(qiáng)，對(duì)于極性強(qiáng)的化合物，在十八烷基鍵合相的色譜柱中，保留時(shí)間較短，極易流出，故采用強(qiáng)極性色譜柱HILIC柱，對(duì)生物胺的分離及保留效果較好。

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水，乙腈-甲酸銨，乙腈-甲酸銨（含0.02 mol/L甲酸）等多種流動(dòng)相系統(tǒng)，由于甲酸可以提供質(zhì)子，所以離子化的效率也得到提高，同時(shí)質(zhì)譜的響應(yīng)也得到了優(yōu)化。故選擇乙腈-含0.02 mol/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH=4）為流動(dòng)相。

此種檢測(cè)方法，在柱溫40℃下，可滿足TCMI中生物胺的分析檢測(cè)要求。組胺、腐胺、酪胺、色胺、亞精胺均可在10 min內(nèi)得到良好分離，線性范圍為1～200 ng/ml（r> 0.999），組胺、腐胺、酪胺、色胺、亞精胺五種生物胺的檢出限分別為1.0、2.0、1.5、3.0和2.0 μg/L。通過(guò)對(duì)9批次的TCMI樣品進(jìn)行檢測(cè)，其生物胺總量在0～31.5825 μg/ml。

在們檢測(cè)的9批中藥注射液中均未檢出色胺，其中1號(hào)和4號(hào)樣品中五種生物胺均未檢出，可能與其制備工藝有關(guān)。樣品8號(hào)和9號(hào)均為同一廠家生產(chǎn)的不同批號(hào)的疏血通注射液，主要原料為動(dòng)物藥水蛭、地龍，結(jié)果顯示，五種生物胺中除色胺未檢出外，余下的四種生物胺含量均較高；而在植物藥來(lái)源的2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)注射液的檢測(cè)中，生物胺含量遠(yuǎn)低于樣品8號(hào)和9號(hào)。以上原因的出現(xiàn)可能與樣品8號(hào)和9號(hào)中動(dòng)物藥中氨基酸含量較高，游離氨基酸均極易通過(guò)脫羧反應(yīng)降解為生物胺有關(guān)。

由于本方法為直接測(cè)定法，生物胺中組胺及腐胺的穩(wěn)定性較差，需要在12 h內(nèi)測(cè)定完成。目前，可用于中藥注射液的生物胺測(cè)定。本方法簡(jiǎn)單方便，樣品無(wú)須前處理，可為TCMI中生物胺的檢測(cè)提供有效的實(shí)驗(yàn)支持，也可以為TCMI的安全性評(píng)估、臨床安全用藥提供一定的數(shù)據(jù)支持。