王子碩 徐曉軍

中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇南京 210009

N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）修飾是指在腺苷酸的第六位氮原子上添加一個甲基基團[1]，它由一系列調(diào)節(jié)因子催化，這些調(diào)節(jié)因子相互作用，共同發(fā)揮生物學作用。m6A修飾影響著核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的衰變、轉(zhuǎn)錄、剪接、輸出、翻譯、定位和穩(wěn)定性等生物學過程，調(diào)節(jié)下游信號通路和生理功能[2-4]。然而，目前這些研究仍然不能全面揭示m6A修飾的深奧秘密，尤其是在肝臟相關疾病中的生理病理作用，包括非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等。肝臟是病理生理過程中的一個重要器官，具有廣泛的功能，包括營養(yǎng)代謝、解毒、蛋白質(zhì)合成和消化所需的生化物質(zhì)的產(chǎn)生。m6A修飾高度調(diào)節(jié)肝功能和肝病的發(fā)展。本文旨在總結(jié)已鑒定的m6A修飾調(diào)節(jié)因子及其在肝臟疾病發(fā)生過程中的作用，包括肝臟脂質(zhì)代謝相關疾病（NAFLD、NASH）和HCC等。

1 m6A修飾簡介

m6A修飾是一種動態(tài)且可逆的事件，可以在時間及空間上以不同形式進行雙向調(diào)節(jié)。作為最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾，它由一系列調(diào)節(jié)因子催化，包括甲基化酶、去甲基化酶和特定的RNA閱讀蛋白（結(jié)合蛋白）[5]。其中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶也稱為“writers”，負責誘導RNA發(fā)生m6A修飾[6]；m6A去甲基化酶也稱為“erasers”，負責直接去除發(fā)生甲基化RNA的m6A修飾[7]；特定的RNA閱讀蛋白也稱為“readers”，負責特異性識別m6A修飾的RNA的不同子集[8]或與m6A基序結(jié)合，賦予特定的表型結(jié)果[9]。通常m6A修飾各調(diào)節(jié)因子相互作用，并與其他組件形成一個大型復合體發(fā)揮作用，如甲基化酶發(fā)揮甲基化作用需要依賴于閱讀蛋白[6]。這種相互作用涉及多種生理功能和過程，在細胞增殖、脂質(zhì)代謝、NAFLD、NASH、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著獨特的作用。

2 m6A修飾調(diào)節(jié)因子

2.1 m6A甲基化酶

m6A甲基化酶主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶14（methyltransferase like 14，METTL14）、“Wilms”腫瘤1相關蛋白（wilms tumor 1-associated protein，WTAP）、RNA 結(jié)合基序蛋白15（RNA binding motif protein 15，RBM15）、甲基轉(zhuǎn)移酶5（methyltransferase like 5，METTL5）、含鋅指的CCCH結(jié)構(gòu)域蛋白13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13，ZC3H13）和含鋅指的CCCH結(jié)構(gòu)域蛋白4（zinc finger CCCH domain-containing protein 4，ZCCHC4）等。

METTL3是一種S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合亞基，與信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）甲基化有關。METTL14是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的另一個活性成分。METTL3和METTL14在核斑點中共定位，并以1∶1的比例形成穩(wěn)定的復合物。METTL3是主要的催化核心，在細胞質(zhì)中以不依賴m6A的方式優(yōu)先促進某些表觀遺傳因子mRNA翻譯促進腫瘤進展[10]。

WTAP是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的第三個關鍵成分，WTAP作為調(diào)節(jié)亞基的一種甲基轉(zhuǎn)移酶復合物，在基因表達和可變剪接的調(diào)控中起關鍵作用[11]。

RBM15也被認為是甲基轉(zhuǎn)移酶，參與RNA剪接和細胞命運，在腫瘤發(fā)生等病理生理中起關鍵作用[12]。但RBM15如何具體在m6A修飾過程中發(fā)揮甲基化作用尚不清楚。

ZC3H13和ZCCHC4以及METTL5都是新發(fā)現(xiàn)的甲基化調(diào)控因子，是新的甲基轉(zhuǎn)移酶[13]。

2.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶是指甲基化RNA中的N6-甲基腺苷可以被該類酶去除，其作用是確保m6A甲基化是一個動態(tài)和可逆的過程，其成員包括脂肪量和肥胖相關蛋白（fat mass and obesityassociated，F(xiàn)TO）、ALKB 同系物5（ALKB homolog 5，ALKBH5）等[14-15]。

FTO是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶。FTO對RNA中豐富的N6-甲基腺苷殘基具有高效的氧化去甲基化活性，并影響體內(nèi)細胞RNA中m6A的含量[16-17]。

ALKBH5被鑒定為第二種具有生物學功能的去甲基化轉(zhuǎn)移酶，與核斑點共定位并影響mRNA的輸出及代謝過程。ALKBH5敲低導致輕微增加而過表達則輕微減少細胞mRNA中的m6A水平[15]。

2.3 m6A閱讀蛋白

m6A閱讀蛋白是指能夠識別和結(jié)合m6A修飾的蛋白質(zhì)，能夠解碼m6A標記并產(chǎn)生功能信號，導致靶RNA產(chǎn)生不同的歸宿[4，18]。其成員包括YT521-B同源結(jié)構(gòu)域家族蛋白（YT521-B homologous structural domain protein，YTHDF1/2/3和YTHDC1/2）和胰島素樣生長因子 2型 mRNA 結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein，IGF2BPs）等。

YTHDF1、YTHDF3促進或抑制靶向mRNA的翻譯，從而影響基因表達[2，19-20]。YTHDF2能夠招募前體mRNA的剪切因子，調(diào)節(jié)mRNA的剪切和衰變，促進mRNA降解[3]。YTHDC2和YTHDC1一樣都屬于細胞核中的YTH結(jié)構(gòu)域蛋白，也能夠影響m6A修飾的RNA剪切和核輸出過程。YTHDC2是最大的含YTH結(jié)構(gòu)的蛋白，可通過在其共有基序處選擇性結(jié)合m6A來提高其靶標的翻譯效率并降低其mRNA豐度[4]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BPs被認為也能夠結(jié)合m6A甲基化位點并發(fā)揮識別蛋白作用，維持靶mRNA的穩(wěn)定性并促進其翻譯[21]。

3 m6A與肝脂質(zhì)代謝

肝臟中異常的脂質(zhì)積累導致NAFLD，而持續(xù)性脂肪變性和炎癥促進NAFLD向NASH的進展，NAFLD-NASH-HCC的進展是肥胖和代謝綜合征的肝臟后果。越來越多的證據(jù)表明m6A修飾的調(diào)節(jié)因子甲基化酶、去甲基化酶和閱讀蛋白對肝臟脂質(zhì)代謝、NAFLD和NASH均具有重要的調(diào)節(jié)作用。

3.1 甲基化酶與肝脂質(zhì)代謝

METTL3或METTL14增加m6A甲基化水平，改善脂多糖誘導的肝臟損傷和脂質(zhì)代謝紊亂。METTL3抑制細胞周期調(diào)節(jié)因子細胞周期素D1（cyclin D1，CCND1）[22]的表達從而抑制脂肪生成，減少脂質(zhì)沉積并降低脂肪細胞甘油三酯（triglycerides，TG）含量。矛盾的是，有研究發(fā)現(xiàn)METTL3在脂肪肝疾病中扮演著促進的作用，如METTL3通過調(diào)節(jié)酸敏感離子通道1a（acid-sensing ion channel 1a，ASIC1a）對微小RNA（microRNA，miR-350）的加工和成熟，靶向側(cè)支發(fā)芽因子同源物2（recombinant sprouty homolog 2，SPRY2），并通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）途徑促進肝纖維化和脂肪變性[23]。

METTL3在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的相互矛盾的復雜作用暗示m6A修飾在生物學過程中的復雜性，這種相互矛盾的作用可能歸因于METTL3自身充當m6A甲基化酶的作用，也可能是由于其自身發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄抑制因子作用。此外，由于METTL3僅僅是m6A甲基化復合物的成分之一，因此也不能排除甲基化復合物中其他成分對METTL3的影響。

另一甲基化酶METTL14促進NAFLD進展，過表達的METTL14與ATP檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate-citrate lyase，ACLY）和硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA-desaturase，SCD1）的mRNA結(jié)合并改變它們的表達模式，增加ACLY和SCD1的蛋白質(zhì)水平從而促進甘油三酯和膽固醇的產(chǎn)生和脂滴的積累，促使脂質(zhì)代謝紊亂，誘發(fā)NAFLD模型[24]。

3.2 去甲基化酶與肝脂質(zhì)代謝

FTO以其對脂肪生成和代謝的影響而聞名，密切參與肝臟脂質(zhì)代謝的各個方面。在肝脂肪變性小鼠和人類NAFLD和NASH患者的肝臟中均觀察到FTO 的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高。FTO促進了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein，SREBP-1c）和碳水化合物反應元件結(jié)合蛋白（carbohydrate response element binding protein，ChREBP）mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，促進脂質(zhì)積累[25]。FTO還可以通過調(diào)節(jié)抑制過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα）的表達促進肝脂肪變性[14]。

ALKBH5在小鼠和人肝纖維化組織中顯著下調(diào)，ALKBH5通過m6A依賴性方式介導補綴同源物 1（recombinant patched 1，PTCH1）的活化，導致刺猬（hedgehog，Hh）信號通路失活，抑制肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活并改善肝纖維化[15]。這些發(fā)現(xiàn)為ALKBH5介導的m6A去甲基化在肝纖維化中的關鍵作用提供了見解。

3.3 閱讀蛋白與肝脂質(zhì)代謝

FTO通過以m6A-YTHDF2依賴性方式調(diào)節(jié)脂肪生成，說明m6A各調(diào)節(jié)因子之間相互作用共同介導病理生理過程。這也暗示m6A閱讀蛋白在肝病的發(fā)展中也發(fā)揮著關鍵作用。

YTHDF1的敲低阻止了雙氫青蒿素（dihydro artemisinin，DHA）誘導的HSCs的鐵死亡，使DHA減輕肝纖維化的作用失效[26]。

YTHDF2可通過調(diào)控PPARα的轉(zhuǎn)錄與翻譯，影響脂代謝的晝夜節(jié)律，維持生物鐘的穩(wěn)定，減少肝脂質(zhì)代謝疾病的發(fā)生。YTHDF2的下調(diào)抑制脂肪生成基因的mRNA降解，導致脂肪生成增加和過多的脂質(zhì)積累[19]。

YTHDF3可以識別并結(jié)合過氧化還原酶3（recombinant peroxiredoxin 3，PRDX3）的mRNA，調(diào)節(jié)PRDX3的翻譯和表達并降低肝纖維化[18]。

YTHDC2在肥胖小鼠和NAFLD患者的肝臟中均顯著下調(diào)。敲降YTHDC2導致TG含量積累，而過表達YTHDC2改善了肝臟脂肪變性和胰島素抵抗。在機制上，YTHDC2可以與脂肪生成基因的mRNA結(jié)合，降低其mRNA穩(wěn)定性并抑制其基因表達，從而抑制脂肪生成以調(diào)節(jié)TG穩(wěn)態(tài)，抑制肝脂肪變性[4]。

綜上所述，無論是甲基化酶、去甲基化酶還是閱讀蛋白，這些m6A調(diào)節(jié)因子在與肝脂質(zhì)代謝等相關疾病中均扮演著重要作用，然而，目前m6A修飾在調(diào)控肝脂質(zhì)代謝疾病過程中具體的分子機制仍有諸多問題待解決，甚至出現(xiàn)相互矛盾的觀點，而各協(xié)調(diào)因子在調(diào)控肝脂質(zhì)代謝疾病過程中相互協(xié)調(diào)機制也仍未闡明。盡管HFD喂養(yǎng)的小鼠模型已被用于研究m6A在NAFLD和NASH中的作用，但仍然缺乏使用人類樣本的轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A映射數(shù)據(jù)。此外，還需要進一步的研究來闡明m6A調(diào)節(jié)因子在NAFLD-NASH-HCC軸進展過程中的多功能作用。

4 m6A與肝細胞癌

HCC是全球第六大常見癌癥和第三大癌癥相關死亡原因，已在全球范圍內(nèi)造成嚴重的健康負擔，其發(fā)病率持續(xù)上升[27]。

4.1 甲基化酶與肝細胞癌

METTL3通過m6A-YTHDF2依賴性機制促進細胞因子信號抑制因子2（Suppressor of cytokine signaling，SOCS2）的降解，促進HCC進展[28]。然而，這項研究既沒有顯示人類原發(fā)性HCC中的METTL3蛋白水平，也沒有探討正常肝細胞中METTL3耗竭的后果。不過在其他研究中也發(fā)現(xiàn)METTL3在HCC中上調(diào)[10]。

METTL14異常導致發(fā)生HCC的風險增加[29]，METTL14與ACLY和SCD1的mRNA結(jié)合并改變其表達模式，從而誘發(fā)NAFLD小鼠模型，并自發(fā)進展為NASH，纖維化和HCC的組織學特征。然而，低水平的METTL14也被認為是HCC患者預后不良的標志物。目前METTL14在HCC中的機制尚不明確，需要進一步地研究和探索。

METTL3和METTL14在甲基化中的不同作用可能是它們在HCC中相互沖突的表達變化的基礎。此外，METTL3而非METTL14發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶獨立功能以增強mRNA翻譯，這也可能有助于解釋它們的不同表達和生物學功能?？傊琈ETTL3和METTL14可作為潛在的治療靶點。

4.2 去甲基化酶與肝細胞癌

FTO介導環(huán)狀RNAs（circGPR137B）的m6A去甲基化并促進其表達，由此形成了一個由circGPR137B、miR-4739和FTO組成的反饋回路，抑制HCC的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[30]。

ALKBH5在HCC中表達上調(diào)[17]，不過也有報道ALKBH5作為腫瘤抑制因子在HCC中低表達[16]。在機制上，ALKBH5通過ALKBH5-絲裂原活化蛋白激酶激酶8（mitogen activated protein kinase 8，MAP3K8）軸和腫瘤易感候選基因11（cancer susceptibility candidate 11，CASC11）-ALKBH5-泛素結(jié)合酶2（recombinant ubiquitin conjugating enzyme E2，UBE2）軸促進HCC進展，促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移；或通過ALKBH5-Ly6/PLAUR結(jié)構(gòu)域包含蛋白1（Ly6/PLAUR domain-containing 1，LYPD1）軸抑制HCC細胞生長和侵襲。

以上相互矛盾的研究觀點說明ALKBH5介導HCC效應的復雜性，這或許取決于特定的組織環(huán)境和不同的下游分子。不過，這從側(cè)面反映了ALKBH5在HCC中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

4.3 閱讀蛋白與肝細胞癌

YTHDF1在HCC中顯著上調(diào)，通過激活AKT-糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）-β連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路[20]和PI3K-AKT-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路[2]并誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進HCC細胞的遷移和侵襲等惡性行為。

YTHDC1下調(diào)高遷移率族AT Hook蛋白2（high mobility group AT Hook protein 2，HMGA2）的表達，加速肝細胞癌的腫瘤發(fā)生[31]。

YTHDF2也在HCC中高度表達，YTHDF2通過促進METTL3介導的SOCS2 m6A修飾，誘導HCC細胞的增殖、遷移和集落形成[28]。此外，YTHDF2還可以通過調(diào)節(jié)八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（monoclonal antibody to octamer binding transcription factor 4，OCT4）mRNA的m6A甲基化促進肝癌干細胞數(shù)量和肝臟表型，增強體內(nèi)腫瘤負荷和癌癥轉(zhuǎn)移[32]。然而，還有一些研究發(fā)現(xiàn)YTHDF2在HCC中低表達[3]。相反的結(jié)果表明YTHDF2可能同時作為致癌因子或腫瘤抑制因子發(fā)揮雙重作用。這可能與細胞和組織的異質(zhì)性有關。因此，要探索YTHDF2促進或抑制腫瘤進展的確切條件，需要更全面的研究。其次，探索YTHDF2介導的m6A修飾轉(zhuǎn)錄本是闡明其下游調(diào)控機制的首要任務。

5 展望

m6A各調(diào)節(jié)因子之間的相互作用和微環(huán)境可能是NAFLD、NASH、HCC等肝臟疾病發(fā)生和進展的重要機制，這可為肝臟相關疾病的臨床診斷和靶向治療提供啟示。然而，關于肝病更明確的作用機制仍有待闡明，仍需進一步研究m6A修飾失調(diào)與肝病之間的聯(lián)系，仍需進一步研究m6A甲基化的分子機制及其調(diào)控因子。

若進一步探究m6A修飾是否能夠應用于肝臟相關疾病的治療，還需要考慮：第一，m6A修飾可能在肝病中發(fā)揮雙重作用，如在某些情況下具有致癌作用，而在其他情況下具有抑瘤作用。第二，目前關于m6A修飾研究多在細胞或小鼠模型中進行，仍缺乏一定的臨床樣本。第三，m6A修飾同時影響多個通路中的信號分子，單個m6A調(diào)控因子表達的改變可能在多個信號通路的失調(diào)中發(fā)揮關鍵作用。