李明俊，趙冬

雖然，人們對腫瘤的認(rèn)知和理解已經(jīng)取得很大的進(jìn)步，但是，腫瘤依然是威脅人類生命健康的重要原因之一[1]?？紤]到抗腫瘤藥物研發(fā)費(fèi)用高、失敗率高和試驗(yàn)周期長等問題，“老藥新用”抗腫瘤有望成為一種行之有效的治療方案[2]。異丙安替比林(Propyphenazone)是一種安替比林衍生物，并具有與安替比林相類似的解熱、鎮(zhèn)痛功效[3]。然而，這種抗炎藥物對于腫瘤的作用和機(jī)制尚未報(bào)道。我們通過一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林對腎癌細(xì)胞系Caki-1的增殖具有抑制作用，并且初步探究了其作用機(jī)制，為其抗腫瘤作用以及臨床應(yīng)用的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

本研究起止時(shí)間為2016年12月至2017年9月。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人腎癌細(xì)胞系Caki-1和人肝細(xì)胞系LO2由暨南大學(xué)惠贈(zèng)。異丙安替比林購買自MCE公司(貨號(hào)HY-A0273)。MTT(四甲基偶氮唑鹽)和Hoechst 33342購自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自天津三箭有限公司。

1.2 抗體和儀器 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT(蛋白激酶B)、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)、DNA修復(fù)酶(PARP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的蛋白一抗均購自Cell Signaling Technology公司。超凈臺(tái)購買自江蘇蘇凈集團(tuán)，細(xì)胞培養(yǎng)箱購買自Thermo Electron Corporation公司。激光共聚焦顯微鏡購買自O(shè)lympus公司。FACS流式細(xì)胞儀購買自Beckham公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎癌Caki-1細(xì)胞系用McCOY’s 5A培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)、人肝細(xì)胞LO2細(xì)胞系用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)于37 ℃、含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長到80%時(shí)，用0.25%胰酶消化并傳代。

1.3.2 MTT(四甲基偶氮唑鹽)實(shí)驗(yàn) 生長狀態(tài)良好的Caki-1細(xì)胞種于96孔板中，每孔先加入100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度8 000個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后再加入不同濃度的異丙安替比林100 μL，然后置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。MTT檢測前，每孔加入10 μL 5 g/L MTT孵育4～6 h，棄去上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，結(jié)晶充分溶解后，酶聯(lián)檢測儀的波長調(diào)整為570 nm，檢測每孔的光密度值(OD值)，然后，計(jì)算Caki-1細(xì)胞增殖率。

1.3.3 克隆形成抑制實(shí)驗(yàn) 生長狀態(tài)良好的人腎癌細(xì)胞系Caki-1，接種于6孔板中(600個(gè)細(xì)胞/孔)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2周后棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3遍，加入75%乙醇固定15 min，吸去固定液后，適量0.1%結(jié)晶紫染色30 min后，沖洗，干燥，拍照。

1.3.4 Hoechst 33342染色 生長狀態(tài)良好的人腎癌細(xì)胞系Caki-1置于 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌3遍，加入Hoechst 33342避光染色15 min，流水沖洗干凈，晾干，顯微鏡拍照。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 生長狀態(tài)良好的人腎癌細(xì)胞系Caki-1接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的異丙安替比林。48 h后收集細(xì)胞，2 000 r/min，離心5 min，棄去上清，PBS洗1遍，加入200 μL Binding Bufffer吹懸細(xì)胞，分別加入1 μL Annexin V-FITC和1 μL碘化丙啶(PI)，混勻，避光，室溫染色15 min，流式上機(jī)檢測凋亡比例。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測相關(guān)信號(hào)通路蛋白 人腎癌細(xì)胞系Caki-1用不同濃度的異丙安替比林處理24 h后，PBS洗3遍，加入RIPA細(xì)胞裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑)冰上裂解15 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清至新的EP管，然后，BCA法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白上樣跑電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液(TBST)洗4遍，每遍5 min，二抗室溫孵育至少1 h，TBST洗4遍，每遍5 min，化學(xué)發(fā)光顯色。

1.3.7 免疫熒光 生長狀態(tài)良好的Caki-1細(xì)胞種于含有玻片的24孔板，異丙安替比林處理24 h后，吸出原培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每遍3 min。然后，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2遍，每遍3 min，然后，加入0.25% Triton X-100打孔，PBS洗2遍，每遍3 min。加入4%牛血清蛋白(BSA)封閉后孵育一抗(1∶200稀釋)，室溫1 h，吸出液體，PBS(含2%Tween 20)洗2遍，每遍3 min。然后，加入二抗(1∶200稀釋)室溫孵育1 h。吸出液體，PBS(含2%Tween 20)洗2遍，每遍3 min。經(jīng)DAPI染核后，再將玻片取出晾干后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 異丙安替比林對人腎癌Caki-1和人肝細(xì)胞LO2增殖抑制的影響 MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明，對照組Caki-1細(xì)胞增殖率為100%，異丙安替比林(20、40、80、100 μM)組處理24 h的細(xì)胞增殖率分別為(89.1±3.6)%、(80.5±6.2)%、(78.5±3.1)%、(53.2±2.4)%。異丙安替比林(20、40、80、100 μM)組處理48 h的細(xì)胞增殖率分別為(84.5±5.3)%、(82.6±2.5)%、(73.6±4.2)%、(40.6±6.8)%。異丙安替比林(20、40、80、100 μM)組處理72 h的細(xì)胞增殖率分別為(85.7±4.9)%、(63.4±2.1)%、(20.4±2.8)%、(11.4±4.1)%。由此證明，異丙安替比林對Caki-1細(xì)胞增殖呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和濃度依賴性的抑制作用。經(jīng)SPSS 17.0軟件計(jì)算，異丙安替比林處理24 h后，對Caki-1細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)=105 μM；異丙安替比林處理48 h后，對Caki-1細(xì)胞的IC50=83 μM；異丙安替比林處理72 h后，對Caki-1細(xì)胞的IC50=56 μM。然而，對人正常肝細(xì)胞LO2無顯著增殖抑制作用(P>0.05)，見圖1。

2.2 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞克隆形成抑制的作用 異丙安替比林作用于Caki-1細(xì)胞7 d，與對照組相比，隨著異丙安替比林濃度增加，細(xì)胞集落克隆數(shù)顯著減少，并且克隆體積顯著變小(P<0.05)。20 μM和40 μM的異丙安替比林處理Caki-1細(xì)胞后，克隆形成率分別降為38%(P<0.05)和20%(P<0.01)，見圖2。

圖1 異丙安替比林對人腎癌Caki-1(A)和人肝細(xì)胞LO2(B)增殖的影響

2.3 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響 Hoechst 33342染色結(jié)果表明，對照組的Caki-1細(xì)胞核內(nèi)染色均一，說明細(xì)胞狀態(tài)良好。隨著異丙安替比林的濃度增加，Caki-1細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)聚集點(diǎn)，說明Caki-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，并伴隨染色質(zhì)的固縮，見圖3。

2.4 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI檢測凋亡細(xì)胞比例，結(jié)果表明，Caki-1細(xì)胞在不同濃度的異丙安替比林(40 μM、80 μM、100 μM)處理下，隨著濃度增加，凋亡的Caki-1細(xì)胞比例逐漸增加，其中，當(dāng)使用0 μM、40 μM、80 μM和100 μM 的異丙安替林處理Caki-1細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別為7.4%、13.5%、34.5%和50.9%，見圖4。

2.5 Western Blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 不同濃度異丙安替比林處理Caki-1細(xì)胞24 h，隨著藥物處理濃度的增加，p-AKT蛋白表達(dá)逐漸降低，但對AKT蛋白的表達(dá)未有影響，并且PARP出現(xiàn)酶切條帶，證明異丙安替比林抑制了AKT蛋白的活性，并且誘導(dǎo)Caki-1細(xì)胞發(fā)生了凋亡，其中，80 μM處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡最為顯著，見圖5。

圖5 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞凋亡和AKT通路的影響

2.6 異丙安替比林誘導(dǎo)人腎癌Caki-1細(xì)胞自噬 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林(80 μM)處理人腎癌Caki-1細(xì)胞24 h后，LC3出現(xiàn)點(diǎn)狀聚集現(xiàn)象，而DMSO對照組LC3呈現(xiàn)彌漫狀分布，見圖6。這表明異丙安替比林很可能誘導(dǎo)了Caki-1細(xì)胞發(fā)生了自噬現(xiàn)象。

3 討論

腎癌是最為常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第二位[4]，來源于腎上皮組織。流行病統(tǒng)計(jì)研究表明，僅2012年腎癌發(fā)病率占男性惡性腫瘤發(fā)病率的第9位，占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第14位，并仍處于上升趨勢[5]。一旦出現(xiàn)周圍組織侵犯或者遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，五年生存率小于10%。目前，臨床主要治療策略有：腎臟切除、靶向治療和免疫治療[6]。隨之帶來的治療費(fèi)用高、周期長、耐藥風(fēng)險(xiǎn)大等原因，因而迫切需要安全有效的輔助性抗腫瘤藥物。

在這里，我們發(fā)現(xiàn)一種臨床批準(zhǔn)使用的抗炎、鎮(zhèn)痛藥物——異丙安替比林，具有抑制人腎癌細(xì)胞系Caki-1增殖的作用，并且與克隆形成抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果趨勢一致。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林能誘導(dǎo)Caki-1細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步的Hoechst 33342染色更加表明，異丙安替比林使得Caki-1細(xì)胞核發(fā)生染色質(zhì)的固縮，并呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的表型。

AKT，也稱為蛋白激酶B，是PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，是細(xì)胞重要的生存通路，與多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)，如葡萄糖代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移等[7]。AKT可分為3個(gè)亞型：AKT1、AKT2和AKT3[8]。AKT1主要通過抑制凋亡并且誘導(dǎo)胞內(nèi)蛋白合成來促進(jìn)細(xì)胞的生存。AKT2主要參與胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。AKT3的功能未知，尚未有大量的研究報(bào)道。AKT與人類多種腫瘤相關(guān)，而磷酸化的AKT是其活化形式，當(dāng)AKT激活后，會(huì)通過磷酸化下游Forkhead家族的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[9]。細(xì)胞凋亡包括死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL-2)家族介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力(ER-Stress)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。其中，內(nèi)源性凋亡主要由BCL-2家族調(diào)節(jié)，通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-9(Caspase-9)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致下游DNA修復(fù)酶PARP失活，最終使得細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-12]。我們通過Western Blot發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)未有影響，但是顯著下調(diào)磷酸化AKT的表達(dá)，進(jìn)而抑制了AKT蛋白活性，并促進(jìn)PARP切割失活，這些結(jié)果均與細(xì)胞凋亡的表型一致。

LC3由MAP1LC3A基因編碼，是自噬體膜的內(nèi)在組件，主要參與自噬泡的形成過程。LC3被認(rèn)為是細(xì)胞自噬分子標(biāo)志物，并在自噬領(lǐng)域中被廣泛研究[13]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，LC3由Ⅰ型轉(zhuǎn)變?yōu)棰蛐?，并與p62(自噬底物識(shí)別受體)結(jié)合，并被包裹于自噬體內(nèi)膜，此時(shí)，LC3會(huì)在細(xì)胞中發(fā)生點(diǎn)狀聚集[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林處理Caki-1細(xì)胞后，通過激光共聚焦顯微鏡能夠明顯觀察到LC3的點(diǎn)狀聚集，意味著細(xì)胞在藥物處理?xiàng)l件下發(fā)生了自噬。

綜上所述，異丙安替比林能抑制人腎癌細(xì)胞的增殖，并通過抑制AKT和PARP活性而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。本研究工作將有助于異丙安替比林作為廉價(jià)抗癌藥物或輔助抗癌藥物的研究和開發(fā)。

注：與對照組(DMSO)相比，aP<0.05,bP<0.01圖2 異丙安替比林對人腎癌Caki-1克隆形成抑制的影響

圖3 異丙安替比林對人腎癌Caki-1凋亡形態(tài)的影響(Hoechst 33342染色×100)

圖4 異丙安替比林對人腎癌Caki-1凋亡比例的影響

圖6 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞自噬的影響(免疫熒光染色×400)