蘇福娣 李 彪 何 蕓 曾建平

1.廣州市紅十字會醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510240 ；2.廣東祈福醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510220

近年研究認為急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后過度的炎癥反應(yīng)引起心肌細胞及其間質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，是心梗后心室重塑及心力衰竭的重要因素。大量研究表明單核細胞在炎癥反應(yīng)中具有促炎與抗炎的雙重作用，且不同亞群的單核細胞在促炎與抗炎方面的作用表現(xiàn)不同[1]。在2010年公布單核細胞命名共識中，單核細胞被分為三個亞群[2]Mon1、Mon2、Mon3。有關(guān)AMI中單核細胞亞群分布的國內(nèi)外研究中，多數(shù)研究觀察到以Mon2升高最為明顯[3]，但部分研究顯示AMI后Mon1升高更為顯著[4]。關(guān)于AMI中各型單核細胞的促炎性/抗炎性功能的研究甚少，本研究通過觀察STEMI患者中單核細胞的亞群分布、檢測各亞群單核細胞分泌TNF-α、IL-1β的特點，探討單核細胞亞群與STEMI后炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、心室重構(gòu)的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1研究對象 收集2016年1月至2017年6月起病24 h內(nèi)就診于我院的STEMI并在我院行急診PCI治療患者32例，診斷符合2015年中華醫(yī)學(xué)會心血管分會STEMI診斷和治療指南中診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。同時排除以下合并癥者：①先天性心臟??；②瓣膜性心臟??；③心肌??；④NYHA分級Ⅲ、Ⅳ級的慢性心力衰竭；⑤肝腦腎重要器官功能衰竭的；⑥血液系統(tǒng)疾?。虎咦陨砻庖?、結(jié)締組織性疾?。虎嗪喜⒏腥?、腫瘤、及長期使用免疫抑制劑。

入選STEMI組中男22例女性10例，平均年齡(62.5±8.4)歲；對照組男14例，女6例，平均年齡(59.5±9.2)歲，兩組年齡及性別構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2采集信息 STEMI組術(shù)后第二天清晨用EDTA管采集靜脈血5 ml。檢測外周血白細胞、單核細胞計數(shù)。

1.3主要試劑與設(shè)備 PE-CD14單克隆抗體、PE-mouseIgG2a、APC-CD16單克隆抗體、APC- mouse IgG1(CA BioLegend公司)。FITC-CD45單克隆抗體、FITC-mouse IgG1(美國BD Biosciences公司)。IL-1β ELISA、TNF-α ELISA試劑盒(欣博盛生物工程有限公司)。流式細胞分選儀(美國Becton Dickinson公司)。96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning costar公司)。

1.4流式細胞術(shù)檢測

1.4.1分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 用EDTA抗凝管采集空腹外周靜脈血4 ml，離心后去血漿后以1∶1加入含淋巴細胞分離液的離心管中，1800 rpm離心15 min，吸取白膜層即淋巴細胞層后余液轉(zhuǎn)移至新離心管中，再加入PBS，1800 rpm離心12 min后棄上清液再加入PBS混勻后1800 rpm再離心10 min，沉淀細胞團即為PBMC。

1.4.2單核細胞亞群計數(shù) 流式管中加入100 μl去血漿后的外周血，分別加入FITC-CD45單克隆抗體和PE-CD14單克隆抗體以及APC-CD16單克隆抗體各5 μl，分別以FITC-mouse IgG1、PE-mouseIgG2a、APC- mouse IgG1作為同型對照抗體。室溫避光孵育20 min，每管加入1 ml溶血素室溫靜置10 min，每管加入PBS 1ml，1800 rpm離心10 min，再以PBS3 ml洗滌兩遍，1500 rpm離心10 min，棄上清，加入1%多聚甲醛400 μl重懸固定，4 ℃避光保存至上機檢測。采用Flowjo軟件處理數(shù)據(jù)，在CD45-側(cè)向散射光(SSC)點圖上選定單核細胞群，測定各單核細胞亞群比例。

1.4.3單核細胞亞群的分選和體外培養(yǎng) 往PBMC中分別加入PE-CD14單克隆抗體、APC-CD16單克隆抗體、和FITC-CD45單克隆抗體各5 μl。震蕩混勻，孵育20 min，每管洗滌兩遍，1500 rpm離心10 min，洗去未結(jié)合抗體后上機分選，在CD45-側(cè)向散射光(SSC) 點圖上分別選定各單核細胞亞群。用RPMI-1640培養(yǎng)體系重懸各單核細胞亞群。將分選得到的各單核細胞亞群種于96孔板，濃度5×104/ 100 U，各亞群均設(shè)有復(fù)孔。每孔加入LPS 1ug/ml，5%CO2條件下37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液1800 rpm離心10 min，上清液存儲于-20 ℃冰箱，待測炎癥細胞因子濃度。

1.5IL-1β和TNF-α 檢測按ELISA試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1外周血單核細胞 與對照組比較，STEMI組單核細胞具體數(shù)值的增多差異無統(tǒng)計學(xué)意義；單核細胞在白細胞中的占比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 外周血單核細胞總數(shù)及其在白細胞中占比

2.2外周血單核細胞亞群分布 與對照組比較，STEMI組Mon3出現(xiàn)明星擴增(t=5.977，P=0.0072)，Mon2比例亦明顯升高(t=3.676，P=0.0084)，Mon1比例明顯減少(t=-5.753，P=0.001)，見表2。

表2 外周血單核細胞亞群分布

2.3血漿中IL-1β和TNF-α的水平 實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，STEMI組血漿的IL-1β[10.89(0.76～34.38)pg/ml vs 1.32(0.06～4.58) pg/ml，t=8.453，P<0.01]和TNF-α[22.4(1.58～47.52)pg/ml vs 5.62(0.58～9.62)pg/ml，t=15.68，P<0.01]水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4單核細胞亞群分泌促炎癥細胞因子的功能 檢測單核細胞培養(yǎng)上清促炎癥細胞因子，STEMI患者的Mon2分泌IL-1β和TNF-α較Mon1和Mon3明星升高(P<0.01)。見表3。

表3 STEMI各單核細胞亞群炎癥細胞因子分泌功能

3 討 論

近年研究[6-8]表明，單核細胞是促進炎性損傷的主要因素，也是拮抗炎癥反應(yīng)和參與組織修復(fù)的重要因素，其抗炎和促炎性作用取決于其單核細胞亞群的分布。在關(guān)于AMI中單核細胞亞群分布的國內(nèi)外研究中，多數(shù)研究觀察到以Mon2升高最為明顯[3]，但仍有部分研究顯示AMI后Mon1升高更為顯著[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)STEMI患者急診PCI術(shù)后第二天單核細胞在白細胞中的比例增加，同時STEMI患者急診PCI術(shù)后第二天Mon3、Mon2出現(xiàn)明星擴增，Mon1比例明顯減少，提示急性心肌梗死早期，單核細胞亞群中以Mon3增加最為顯著，其次為Mon2，而Mon1擴增最少。2011年Luke D Tapp等研究[3]發(fā)現(xiàn)STEMI早期以Mon2升高為主，其次是Mon1而Mon3則無明顯增加，與本研究結(jié)果存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)STEMI患者早期外周血中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平明顯升高；同時各亞群單核細胞培養(yǎng)證實Mon2分泌IL-1β和TNF-α能力較Mon3和Mon1強。該結(jié)果與國外Rossol等[9]及Cros等[10]的研究基本一致。提示急性心肌梗死后早期的炎癥反應(yīng)可能通過Mon2途徑激活和/或加強，為今后急性心肌梗死后心肌局部和全身炎癥反應(yīng)的研究提供思路。

該研究樣本量小，為單一橫斷面研究，沒有多時間點動態(tài)觀察外周血單核細胞各亞群的變化及其炎癥因子分泌功能。今后我們將增加樣本同時設(shè)置多個觀察時間點進行觀察，動態(tài)觀察單核細胞各亞群分布及其與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。