宋路路，于 俏，齊學潔，楊愛紅，張昕陽，申 蕊，寇曉娣，趙利花（.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 3067；.天津大學仁愛學院化工系，天津 30636）

呫噸酮（Xanthone）是傳統(tǒng)中藥遠志、藤黃、龍膽等的化學成分與藥效物質基礎之一[1-3]。呫噸酮在其線性排列的二苯并γ-吡喃酮環(huán)上有8個可以取代的位置（圖1a），所以容易形成多樣的結構并且表現(xiàn)出廣泛的生物活性，如抗腫瘤[4-5]、抗菌[6]、抗氧化[7]、抑制乙酰膽堿酯酶[8]、抑制α-葡萄糖苷酶[9]、抑制神經(jīng)氨酸酶等[10]。優(yōu)呫噸酮（Euxanthone，圖 1b）是中藥遠志、尾葉遠志等中的有效化學成分，屬于1、7位二氧取代呫噸酮，具有生長刺激、抑制血小板聚集、抑制腫瘤細胞增殖等活性[11]。根據(jù)中藥有效化學成分的配位化學學說[12]，優(yōu)呫噸酮結構中1位羥基氧原子與9位羰基氧原子的位置特殊，極易與金屬離子配位，產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用，影響原有的生物活性或產(chǎn)生新的生物活性。而且優(yōu)呫噸酮的三環(huán)結構具有良好的平面性和共軛體系，可以與DNA的堿基對發(fā)生堆積作用[13]。而DNA是臨床常用抗腫瘤藥物的靶向分子之一。小分子藥物可以通過直接或間接的方式造成DNA損傷來發(fā)揮其抗腫瘤作用[14]。所以小分子與DNA的作用方式對于藥物設計、藥理、毒性等研究都有重要的意義。本實驗擬以優(yōu)呫噸酮為配體，合成優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物，利用金屬離子的特殊生理活性，提高優(yōu)呫噸酮對食管鱗癌細胞（ECA109）、胃癌細胞（SGC7901）和宮頸癌細胞（Hela）的體外抑制活性，并且利用光譜學方法研究配合物與小牛胸腺DNA的相互作用，為進一步研究基于中藥活性成分的金屬配合物抗腫瘤作用機制和中藥配伍理論研究提供實驗依據(jù)。

圖1 呫噸酮（a）和優(yōu)呫噸酮（b）的分子結構Fig.1 The structure of Xanthone（a）and Euxanthone（b）

1 儀器與試劑

1.1 儀器 元素分析儀（Perkin Elmer EA 2400Ⅱ），傅里葉紅外光譜儀（Perkin-Elmer FTIR），酶標儀（Bio-Tek），熒光分光光度計（Hitachi F-4600），紫外可見光譜儀（Varian Cary100），圓二色譜儀（Bio-Logic MOS-450）。

1.2 試劑 小牛胸腺DNA（ct-DNA）、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、新生小牛血清、噻唑藍（MTT）、溴化乙錠（EB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）購于Solarbio公司，其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物的合成 將0.20 mmol優(yōu)呫噸酮溶于10 mL乙醇中，室溫攪拌至完全溶解，加入0.20 mmol的NaOH，繼續(xù)攪拌20 min。然后加入0.10 mmol的CuCl2，室溫攪拌8 h，陳化 24 h，離心分離。沉淀用乙醇洗滌，80℃下真空干燥，得到優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物。

2.2 細胞毒性 取對數(shù)生長期的ECA109、SGC-7901、Hela細胞制成5×104/mL的單細胞懸液，接種于96孔板，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入不同濃度的待測物（0、1.56、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0 μg/mL），培養(yǎng) 44 h。然后加入 5 mg/mL 的MTT（10 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。移走培養(yǎng)基后加入DMSO，震蕩搖勻后測定各孔570nm處的光密度（A）。細胞生長抑制率IR=（1-A/A0）×100%。待測物用含有DMSO的培養(yǎng)基溶解（DMSO終體積＜0.5%）。

2.3 優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物與DNA的相互作用 DNA熱穩(wěn)定性實驗使用1 mmol/L Tris、0.1 mmol/L Na2EDTA的Tris-HCl緩沖溶液（pH=7.3），其他與DNA相互作用實驗使用5 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖溶液（pH=7.3）。銅（Ⅱ）配合物用含有DMSO的緩沖溶液溶解（DMSO終體積＜0.5%）。

2.3.1 銅（Ⅱ）配合物對DNA-EB復合體系熒光光譜的影響 樣品池中加入DNA-EB溶液（[DNA]=20 μmol/L，[EB]=2 μmol/L），Ex=500.0 nm 激發(fā)，測定520～720 nm的DNA-EB復合體系熒光光譜。然后逐漸增加銅（Ⅱ）配合物濃度，測定DNA-EB復合體系熒光光譜的變化。根據(jù)Stern-Volmer方程F/F0=1+Kq[Q]，計算動態(tài)猝滅常數(shù) Kq[15]。

2.3.2 銅（Ⅱ）配合物對DNA溶液紫外光譜的影響 樣品池中加入10 μmol/L DNA溶液，測定DNA在230～320 nm的吸收光譜；然后逐漸增加銅（Ⅱ）配合物濃度，測定DNA紫外光譜的變化。

2.3.3 銅（Ⅱ）配合物對DNA溶液圓二色譜的影響 樣品池中加入5 μmol/L DNA溶液，測定DNA在200～450 nm的圓二色譜；然后加入銅（Ⅱ）配合物溶液（[配合物]=5 μmol/L），測定 DNA 圓二色譜的變化。

2.3.4 銅（Ⅱ）配合物對DNA熱穩(wěn)定性的影響 樣品池中分別加入DNA溶液（[DNA]=5 μmol/L）和DNA-銅（Ⅱ）配合物溶液（[DNA]=5 μmol/L，[配合 物]=5 μmol/L），在 50～100 ℃間檢測 DNA 在260 nm處吸光值的變化，升溫速度為2℃/min，tm為熔解溫度。

3 實驗結果

3.1 優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物的元素分析 紅外光譜銅（Ⅱ）配合物為黃綠色粉末，產(chǎn)率65.25%。C、H元素含量由元素分析儀測定，Cu金屬含量用EDTA絡合滴定法（二甲酚橙作為指示劑）[16]測定。元素分析按 C26H14O8Cu計算值（%）：C，60.29；H，2.71；M，12.27。實驗值（%）：C，60.51；H，2.69；M，11.78。IR（KBr，cm-1）：3203（νO-H），1620（νC=O），1563（νC=C），1266（νAr-O），1033（νC-O-C），807（δAr-H），679（ρw O-H）。優(yōu)呫噸酮γ-吡喃酮環(huán)上羰基的特征伸縮振動峰（νC=O）為 1 652 cm-1，與 Cu2+配位后振動減弱，向低波數(shù)方向移動了32 cm-1左右。

3.2 細胞毒性優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物對腫瘤細胞的作用 對ECA109、SGC7901和 Hela腫瘤細胞呈現(xiàn)濃度依賴性抑制，并且明顯優(yōu)于優(yōu)呫噸酮，見圖 2。其半抑制率濃度（IC50）分別（22.27±1.28）、（28.61±1.57）和（21.11±1.19）μg/mL。表 1。

3.3 優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物與DNA的相互作用 隨著銅（Ⅱ）配合物濃度的增加，DNA-EB復合體系在587 nm附近的特征熒光峰強度逐漸減弱，并在550 nm附近出現(xiàn)等電勢點，動態(tài)猝滅常數(shù)Kq=1.62×104（圖3），而DNA紫外光譜在260 nm附近的征吸收峰則發(fā)生了明顯的增色效應（圖4）。DNA的圓二色譜在加入銅（II）配合物后，原來在245 nm處由雙螺旋結構引起的負吸收峰和275 nm處由堿基對堆積引起的正吸收峰都明顯增強，見圖5。DNA的熱穩(wěn)定性實驗表明銅（II）配合物與DNA作用后，DNA的熔解溫度上升了6.5°C，見圖6。

圖2 優(yōu)呫噸酮（●）和銅（Ⅱ）配合物（■）對ECA109、SGC7901和Hela細胞的抑制作用Fig.2 Inhibition ratio of Euxanthone（●）and complex（■）on ECA109，SGC7901 and Hela cells

表1 優(yōu)呫噸酮和銅（Ⅱ）配合物對ECA109、SGC7901和Hela細胞的半抑制率濃度Tab.1 IC50of Euxanthone and complex against ECA109，SGC7901 and Hela cells

圖3 銅（Ⅱ）配合物對DNA-EB復合體系熒光光譜的影響Fig.3 Fluorescence emission spectra of DNA-EB upon addition of Cu（Ⅱ）complex

圖4 銅（II）配合物對DNA溶液吸收光譜的影響Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of DNA upon addition of Cu（II）complex

圖5 銅（Ⅱ）配合物對DNA溶液圓二色譜的影響Fig.5 Circular dichroic spectra of DNA in the absence and presence of Cu（Ⅱ）complex

圖6 銅（II）配合物對DNA熱穩(wěn)定性的影響Fig.6 Thermal denaturization curves of DNA

4 討論

本實驗通過元素分析、紅外光譜推測優(yōu)呫噸酮銅（II）配合物的化學組成為Cu·（L）2（L=失去1位羥基氫的優(yōu)呫噸酮），即Cu2+與兩個優(yōu)呫噸酮分子的二苯并-吡喃酮環(huán)上的羰基氧和1位上失去質子的羥基氧以雙齒形式配位，形成四配位的結構，見圖7。銅（II）配合物使EB-DNA復合體系的熒光減弱，說明配合物與DNA發(fā)生了類似于EB的插入作用，競爭了EB與DNA結合的位點。并且DNA-EB體系熒光光譜變化F/F0與配合物濃度[Q]的線性關系良好，說明配合物與DNA為單一插入作用。DNA紫外光譜的增色效應說明配合物插入DNA雙螺旋堿基對間，改變了構成堿基堆積力的疏水作用力和范德華力，影響了雙螺旋結構。圓二色譜實驗結果進一步證明了配合物與DNA發(fā)生了插入作用，增強了堿基的堆積作用穩(wěn)定了DNA的雙螺旋結構，這一點從DNA的熱穩(wěn)定性實驗中也得到了證實。根據(jù)上述結果筆者推測優(yōu)呫噸酮與Cu2+配位后，可能影響了平面芳香體系電子云密度的分布，進而影響了優(yōu)呫噸酮的藥理活性。同時Cu2+配位后，芳香體系的平面性更好，更利于插入DNA的堿基對，引起腫瘤細胞的DNA損傷，進而抑制細胞生長，表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性并且活性明顯優(yōu)于優(yōu)呫噸酮。由于細胞的復雜性，優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物具有細胞毒性的其他可能機制也在進一步的研究中。

圖7 優(yōu)呫噸酮銅（Ⅱ）配合物的結構Fig.7 The structure of Euxanthone Cu（Ⅱ）complex