肖文海，楊政偉，李 遠(yuǎn)

（1.重慶市大足區(qū)中醫(yī)院，重慶 402360；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 402160）

大量研究證實(shí)機(jī)體內(nèi)過量自由基形成及其誘發(fā)的“瀑布式”自由基連鎖反應(yīng)將造成生物膜損傷、蛋白質(zhì)變性、DNA錯(cuò)誤復(fù)制及酶失活等，進(jìn)而引發(fā)生物體內(nèi)各種疾病產(chǎn)生[1]。在生理狀態(tài)下，由系列酶和非酶復(fù)合物組成的體內(nèi)抗氧化防御體系能夠在氧自由基產(chǎn)生后即時(shí)清除以維持體內(nèi)平衡。然而，在嚴(yán)重氧化應(yīng)激條件下，單獨(dú)的機(jī)體內(nèi)抗氧化體系不能完全消除過量自由基，進(jìn)而造成機(jī)體氧化損傷。另一方面，大量研究顯示一些源于天然植物的物質(zhì)具有抗氧化效應(yīng)，可作為的潛在藥物有效地抑制和清除機(jī)體內(nèi)的過量自由基，進(jìn)而阻斷自由基參與的一系列不良氧化反應(yīng)[2]。參麥注射液是由人參、麥門冬為組分制成的中藥復(fù)方注射液，中醫(yī)理論上具有“益氣固脫、養(yǎng)陰生津，生脈”功效[3]。此外，一些體內(nèi)和臨床實(shí)驗(yàn)還顯示參麥注射液具有減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞損傷和降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的效果，進(jìn)而用于缺血性腦卒中的臨床治療和改善腦缺血-再灌注導(dǎo)致的肺損傷[4-5]。然而，參麥注射液相關(guān)的體外抗氧化性能卻鮮見文獻(xiàn)報(bào)道[6]。因此。本研究將系統(tǒng)評(píng)價(jià)參麥注射液的體外抗氧化活性，為參麥注射液體內(nèi)臨床抗氧化應(yīng)激藥理學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)。

1 試劑和儀器

1.1 主要試劑 2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、檸檬酸、過氧化氫、氯化亞鐵（FeCl2）、菲啰嗪、硝普鈉均為分析純，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；參麥注射液（批號(hào)：1703101）由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，根據(jù)臨床用法用量用生理鹽水分別稀釋10、20、40、60、80 和 100 倍后進(jìn)行測(cè)試；總抗氧化能力（TAC）比色法定量檢測(cè)試劑盒（DPPH法）由赫澎（上海）公司提供；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法）、一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒由碧云天生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要儀器 Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電）、震蕩恒溫孵育箱（上海智誠(chéng)）。

2 方法

2.1 總抗氧化能力 參麥注射液總抗氧化能力通過總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法）進(jìn)行檢測(cè)，流程按試劑盒說(shuō)明書操作。流程如下：首先在96孔板每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μL FRAP工作液，在樣品孔中加入5 μL不同濃度待測(cè)樣品；空白對(duì)照孔中加入5 μL生理鹽水；標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中加入5 μL不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。輕輕混勻，37℃孵育5 min，測(cè)試溶液在593 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。吸光度值越大代表樣品具有越高總抗氧化能力。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算參麥注射液的總抗氧化能力，并用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度來(lái)表示。實(shí)驗(yàn)以0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L水溶性維生素E（Trolox）、10%檸檬酸作為對(duì)照進(jìn)行比較。

2.2 DPPH自由基（DPPH·）清除活性 參麥注射液DPPH·清除活性采用總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH法）定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)量，按試劑盒說(shuō)明書操作。流程如下：取20 μL不同濃度待測(cè)樣品加入96孔板中，加入試劑盒提供的205 μL緩沖液，25 μL染色工作液，輕搖96孔板混勻，室溫孵育15 min后，測(cè)試混合液在515nm波長(zhǎng)處吸光度值，吸光度值越低代表樣品具有越高的DPPH·清除活性。DHHP·清除活性（%）=（Ac-As）/Ac×100，Ac 為空白組吸光度值、As為含不同樣品的混合液吸光度值。實(shí)驗(yàn)以 0.1mg/mL BHT、10mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對(duì)照進(jìn)行比較。

2.3 一氧化氮自由基（NO·）清除能力 參麥注射液NO·清除能力通過Griess法反應(yīng)進(jìn)行量化[7]，按NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。流程如下：將1 mL不同濃度待測(cè)樣品與1 mL濃度為10 mmol/L的硝普鈉溶液中混合，25℃孵育150 min。取50 μL混合液加入到96孔板中，依次加入劑盒中提供的50 μL Griess Reagent I、50 μL Griess Reagent II溶液，充分混合后室溫反應(yīng)10 min，測(cè)試溶液在540 nm波長(zhǎng)吸光度值，吸光度值越低表示樣品具有越高的NO·清除活性。NO·清除活性（%）=（Ac-As）/Ac×100，Ac為空白組吸光度值，As為含不同樣品的混合液吸光度值。實(shí)驗(yàn)以 0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對(duì)照進(jìn)行比較。

2.4 過氧化氫（H2O2）清除能力 參麥注射液H2O2清除能力測(cè)試參考文獻(xiàn)[8]。流程如下：用生理鹽水配置40 mmol/L過氧化氫溶液；取100 μL不同濃度待測(cè)樣品加入到600 μL過氧化氫溶液中，用生理鹽水定容到3 mL，室溫震蕩孵育30 min；空白樣品中只含生理鹽水和過氧化氫溶液；測(cè)試溶液在230 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。吸光度值越低代表樣品具有越高的 H2O2清除活性。H2O2清除活性（%）=（Ac-As）/Acx100，Ac為空白組吸光度值，As為含樣品溶液吸光度值。實(shí)驗(yàn)以0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對(duì)照進(jìn)行比較。

2.5 亞鐵（Fe2+）離子螯合活性 參麥注射液Fe2+離子螯合活性測(cè)試參考文獻(xiàn)[9]。流程如下：取100 μL不同濃度待測(cè)樣品加入生理鹽水400 μL，隨后依次加入 10 μL 2 mmol/L FeCl2溶液和 20 μL 菲啰嗪溶液，混勻后室溫孵育10 min，空白對(duì)照中不含待測(cè)樣品。測(cè)試混合溶液在562 nm波長(zhǎng)處吸光度值，吸光度值越低代表樣品具有越高Fe2+離子螯合活性。Fe2+離子螯合活性（%）=（Ac-As）/Ac×100，Ac 為空白樣品吸光值，As為含樣品溶液吸光度值。實(shí)驗(yàn)以0.1 mg/mL BHT、10 mmol/L Trolox、10%檸檬酸作為對(duì)照進(jìn)行比較。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間均值比較采用單因素方差分析，分析前采用Levene法對(duì)多組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性條件滿足時(shí)采用Dunnett-t進(jìn)行均值比較，方差齊性條件不滿足時(shí)采用Dunnett’s T3進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 總抗氧化能力 不同稀釋倍率參麥注射液總抗氧化能力如圖1（A）所示，顯示總抗氧化能力隨稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液總抗氧化能力顯著低于 BHT、Trolox抗氧化能力（P＜0.01），但高于檸檬酸總抗氧化能力（P＜0.01），結(jié)果如圖1（B）所示。

3.2 DPPH·清除活性 不同稀釋倍率的參麥注射液DPPH·清除活性如圖 1（C）所示，顯示 DPPH·清除活性隨稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液DPPH·清除活性顯著低于BHT、Trolox抗氧化能力（P＜0.01），與檸檬酸DPPH·清除活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如圖 1（D）所示。

3.3 NO·清除活性 不同稀釋倍率的參麥注射液NO·清除活性見圖1（E）所示，顯示其NO·清除活性稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液NO·清除活性顯著高于BHT（P＜0.05）、Trolox和檸檬酸（P＜0.01），如圖 1（F）所示。

3.4 H2O2清除活性 不同稀釋倍率的參麥注射液H2O2清除活性見圖1（G）所示，顯示其H2O2清除活性稀釋倍率減少而增大。稀釋10倍參麥注射液H2O2清除活性與檸檬酸相當(dāng)（P＞0.05），顯著低于BHT（P＜0.01）和 Trolox（P＜0.05），如圖 1（H）所示。

3.5 Fe2+離子螯合活性 不同稀釋倍率的參麥注射液Fe2+螯合活性隨稀釋倍率減少而增大，見圖1（I）所示。稀釋10倍參麥注射液亞鐵離子螯合活性顯著高于 BHT、Trolox和檸檬酸（P＜0.01），如圖 1（J）所示。

3.6 不同自由基清除活性比較 10倍稀釋參麥注射液對(duì)不同自由基具有不同的清除能力，其中，NO·[（54.4±6.6）%]＞Fe2+離子螯合[（42.6±3.2）%]＞DPPH·[（36.2±2.8）%]＞H2O2[（23.5±1.2）%]。

圖1 參麥注射液體外抗氧化活性Fig.1 In vitro antioxidant activity of Shenmai injection

4 討論

近年來(lái)大量研究表明生物體內(nèi)過量的氧自由基及氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心血管系統(tǒng)、腫瘤及退行性病變的重要原因之一[10]。參麥注射液作為人參、麥門冬為組分制成的中藥復(fù)方注射液，除具有“益氣固脫、養(yǎng)陰生津，生脈”的中醫(yī)功效外，在機(jī)體內(nèi)還具有潛在的抗氧化作用，可用于臨床改善缺血性腦卒中帶來(lái)的氧化應(yīng)激損傷[11]。為闡明臨床上參麥注射液的抗氧化應(yīng)激機(jī)制，本研究體外系統(tǒng)研究了參麥注射液抗氧化性能，并與BHT（人工合成抗氧化劑）、Trolox（維生素E類似物，抗氧化能力與維生素E相當(dāng)）和檸檬酸（天然抗氧化物質(zhì)）3種常用抗氧化劑的體外抗氧化性能進(jìn)行比較。

參麥注射液總抗氧化能力采用FRAP法進(jìn)行分析。本結(jié)果說(shuō)明參麥注射液樣品中的含有某種抗氧化性活性成分，且10倍稀釋參麥注射液總抗氧化能力高于檸檬酸，但低于BHT和Trolox。進(jìn)一步證實(shí)參麥注射液具有體內(nèi)抗氧化性能的物質(zhì)基礎(chǔ)。

DPPH·是一種穩(wěn)定呈紫紅色的自由基，在515nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。當(dāng)溶液中有抗氧化成份存在時(shí)，可向DPPH·提供氫原子和電子，使其發(fā)生褪色。溶液吸光度值降低越多，說(shuō)明抗氧化成份抗氧化性越強(qiáng)。不同稀釋倍數(shù)的參麥注射液清除DPPH·的活性結(jié)果說(shuō)明參麥注射液具有一定的清除DPPH·功能，其活性與檸檬酸相當(dāng)，但低于BHT和Trolox。

NO·是活性氧自由基（ROS）家族中重要成員，在人體內(nèi)可作為內(nèi)皮細(xì)胞松弛因子、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)逆信使參與眾多的炎癥反應(yīng)、腫瘤、腦卒中和其它退行性病理?xiàng)l件[12]。在本測(cè)試中，NO·由硝普鈉提供，抗氧化物質(zhì)清除后剩余的NO·在水溶液中氧化形成二氧化氮（NO2），并能夠與Griess試劑反應(yīng)生成在540 nm波長(zhǎng)具有最大吸收峰的反應(yīng)物。樣品清除NO·活性越大，混合物吸光度值越低。不同稀釋倍率的參麥注射液NO·清除活性結(jié)果證實(shí)了參麥注射液具有清除NO·能力，10倍稀釋的參麥注射液NO·清除活性高于BHT、Trolox和檸檬酸。

H2O2是一個(gè)弱氧化物，雖然其自身氧化反應(yīng)活性不強(qiáng)，但H2O2可快速地跨過細(xì)胞膜，并與膜內(nèi)二價(jià)鐵離子和二價(jià)銅離子反應(yīng)生成羥基自由基，從而產(chǎn)生毒性[13]。因此，H2O2的清除是細(xì)胞或人體系統(tǒng)中非常重要的抗氧化防御能力。不同稀釋倍率的參麥注射液H2O2清除活性結(jié)果，說(shuō)明參麥注射液具有一定的H2O2活性，其活性與檸檬酸相當(dāng)，但低于BHT和Trolox。

過渡金屬Fe2+離子能夠獲得或失去自由電子，具有產(chǎn)生新自由基的能力。大多數(shù)ROS是線粒體電子轉(zhuǎn)移和其它代謝反應(yīng)過程中形成的副產(chǎn)物，而部分ROS則來(lái)源于過渡金屬催化氧化反應(yīng)。研究顯示過量Fe2+離子造成的ROS氧化損傷與多種神經(jīng)性疾病有關(guān)，如老年癡呆癥、帕金森氏病等[14]。因此，過量Fe2+離子的清除具有重要意義，而通過對(duì)Fe2+離子的螯合反應(yīng)能夠降低ROS形成和氧化損傷。不同稀釋倍率的參麥注射液對(duì)Fe2+離子螯合活性如圖（I）和（J）所示，說(shuō)明參麥注射液具有能螯合 Fe2+離子的成份，且螯合Fe2+離子活性高于BHT、Trolox和檸檬酸。

5 結(jié)論

文章系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)參麥注射液的體外抗氧化活性，包括總抗氧化能力、清除DPPH·、NO·、H2O2和亞鐵離子（Fe2+）螯合活性。結(jié)果顯示參麥注射液具有一定的體外抗氧化能力，且活性呈濃度正依賴性。同時(shí)證實(shí)了參麥注射液對(duì)不同自由基清除能力存在差異。本研究結(jié)果將為參麥注射液抗氧化應(yīng)激藥理學(xué)機(jī)制提供體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋。文章不足之處在于僅采用單一廠家生產(chǎn)的參麥注射液產(chǎn)品，同時(shí)未進(jìn)行量-效關(guān)系分析。