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        西洋參不同部位皂苷成分研究*

        2019-07-20 02:46:04劉俊文徐美利牛志平連運(yùn)河喬延江
        天津中醫(yī)藥 2019年7期
        關(guān)鍵詞:西洋參皂苷人參

        劉俊文,徐美利,徐 冰,牛志平,高 偉,連運(yùn)河,喬延江

        (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥信息工程研究中心,北京 100029;2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司,邯鄲 057250)

        西洋參(Panax quinquefoliumL.)為五加科人參屬多年生草本植物,又稱花旗參,洋參等,其性涼,味甘、微苦,具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效。原產(chǎn)于與美國的威斯康辛州,中國北京懷柔、吉林長白山、山東文登等地均有種植。近年來,關(guān)于西洋參的研究報(bào)道較多,無論是其地上部分還是地下部分均有很高的藥用價(jià)值。西洋參中主要有效成分是三萜皂苷,具有抗腫瘤、抗癌、降血壓、降血脂、抗疲勞等多方面的藥理活性[1]。中國西洋參雖然產(chǎn)量較大,但是仍滿不足了國內(nèi)需求,需要從國外進(jìn)口。筆者通過對(duì)西洋參不同部位皂苷的含量測(cè)定,明確了各部位皂苷含量,為西洋參綜合利用與開發(fā)提供參考依據(jù)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器 UV-1102型紫外可見分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司),W2-100sp型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海中生科技有限公司),HHS-21-4水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司),KQ-500DA型超聲波清洗(昆山市超聲儀器有限公司),F(xiàn)W135型粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)

        1.2 材料 甲醇、乙腈、正丁醇、石油醚均為分析純,購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品 Rg1(批號(hào) 110703-201832)、Re(批號(hào)110754-201827)、Rb1(批號(hào) 111818-201603)、Rc(批號(hào) R-008-120628)、Rb2(批號(hào) 111715-201203)、Rb3(批號(hào)111686-201504)、Rd(批號(hào) 111818-201603),均購于中國食品藥品檢定研究院;整株西洋參購自山東文登地區(qū),北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒別為五加科植物西洋參(Panax quinquefoliumL.)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 色譜柱:C18色譜柱(250 mm×3 mm,5 μm)流動(dòng)相為 A:乙腈;B:0.1%磷酸水溶液,洗脫梯度:0~25 min,19%~20%A;25~60 min,20%~40%A;60~65 min,40%~19%A;檢測(cè)波長為 203 nm;柱溫 40℃;進(jìn)樣量為 10 μL。

        2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 適量,置于 10 mL 容量瓶中,加甲醇溶解,分別制成濃度為0.958、0.265、0.993、0.978、0.971、0.972、0.231 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液,搖勻,然后用0.45 μm的微孔濾膜濾過,備用。

        2.3 供試品溶液的制備 取西洋參全草若干,并將各部位(花蕾、莖、葉、蘆頭、主根、側(cè)根、須根、參皮、參芯)分離,粉碎,過40目篩,精密稱取1.000 g,將各部位粉末用300目濾布包裹,加適量石油醚超聲30 min,去除葉綠素及脂肪。取出,將石油醚揮干,加80%甲醇回流提取4次,每次用量30 mL,每次提取30 min。將4次提取液合并,濃縮蒸干,加適量蒸餾水溶解殘?jiān)?,并用蒸餾水洗滌容器,將以上溶液合并(約30 mL);將合并液置于分液漏斗中,用正丁醇萃取3次,每次用量10 mL,合并正丁醇萃取液,置于分液漏斗中,用20 mL蒸餾水洗滌;將洗滌后的正丁醇溶液蒸發(fā)至干,用適量甲醇溶解殘?jiān)?,并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,并用0.45 μm的微孔濾膜過濾,即得供試溶液[2]。

        2.4 方法學(xué)考察

        2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取含7種皂苷的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2、6、10、14、20 μL 注入高效液相色譜儀,以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

        表1 7種人參皂苷線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.1 Linearity regression equations of 7 ginsenosides

        2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè),記錄峰面積,計(jì)算人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 的 RSD 分別為0.68%、0.72%、0.64%、0.57%、0.45%、0.50%、0.47%,表明儀器的精密度良好。

        2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取西洋參葉供試樣品6份,按“2.3”項(xiàng)下條件處理后,進(jìn)行含量檢測(cè),其人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 的 RSD 分 別 為1.1%、0.52%、1.9%、1.1%、0.61%、0.48%、0.66%,表明此方法重復(fù)性良好。

        2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取西洋參葉供試樣品,在室溫條件下放置,分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣,按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè),人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的RSD 分別為 1.7%、0.91%、1.90%、1.05%、0.75%、0.69%、0.81%,表明樣品中的各人參皂苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4.5 加樣回收率精密 稱取已知含量的西洋參葉供試樣品6份,加入一定量的人參皂苷混合標(biāo)品,按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算回收率,結(jié)果見表2。

        表2 加樣回收率(n=6)Tab.2 Sample recovery rate(n=6)

        2.4.6 西洋參各部位含量測(cè)定 結(jié)果取西洋參各部位,參照“2.3”項(xiàng)下條件制備樣品,進(jìn)高效液相色譜并測(cè)定各皂苷含量,測(cè)定結(jié)果見表3,對(duì)照品和西洋參各部位圖譜見圖1。

        2.5 主成分分析 采用SIMCA 13.0軟件進(jìn)行主成分分析。本實(shí)驗(yàn)選取了兩個(gè)主成分,其特征值分別為4.27、1.74,均大于1,累積方差貢獻(xiàn)率為85.8%,即這兩個(gè)主成分可以代表7個(gè)指標(biāo)在9種部位中的85.8%的信息。載荷量表示主成分與對(duì)應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)[3],其值越大,表明該成分在主成分分析中作用越大,如圖2載荷圖所示,人參皂苷Re和Rd對(duì)第一主成分的影響最大,而人參皂苷Rb1對(duì)于第二主成分影響最顯著。

        表3 西洋參各部位皂苷含量(x±s,n=3)Tab.3 The contents of saponins in different parts of Panax quinquefolium(x±s,n=3)

        圖1 人參皂苷對(duì)照品及西洋參不同部位HPLC圖Fig.1 HPLC chromatography of ginsenoside reference substances and different parts of Panax quinquefolium L.

        圖2 載荷圖Fig.2 Loading plots

        2.6 聚類分析 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn),采用組間聯(lián)接的方法,以7種人參皂苷成分為變量對(duì)西洋參9個(gè)部位進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖3所示,當(dāng)距離為25時(shí),可聚為兩類,第一類:花蕾和葉,第二類:側(cè)根、參皮、主根、參芯、莖、蘆頭和須根;當(dāng)距離為15時(shí),可聚為4類,第一類:花蕾和葉,第二類:須根和蘆頭,第三類:主根、參芯及莖,第四類:側(cè)根、參皮。結(jié)合主成分得分圖(圖4),S1和S9距離較近,其成分相近,成為一類,S2~S8分布較為集中,可成為一類,此結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

        圖3 西洋參不同部位聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis of different parts of Panax quinquefolium L.

        圖4 得分圖Fig.4 Score plots

        3 討論

        通過西洋參各部位皂苷檢測(cè),各部位均含有一定量的人參皂苷,西洋參地上部分花蕾和葉中總皂苷含量均較高,分別為9.74%和6.54%,其含量較多的皂苷為Rb3,其具有腦保護(hù)、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)、心血管保護(hù)、抗抑郁和抗糖尿病等功效[4],西洋參地上部分資源量豐富,具有較高的開發(fā)利用價(jià)值;地下部分總皂苷含量從高到低依次是須根、蘆頭、側(cè)根、參皮、參芯、主根。人參皂苷Rb1和Re在各部位均較高,其中Rb1可通過多種途徑對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用,并對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病有一定的治療作用[5]。Re也具有相同功效,并具有降糖和抗休克等作用。

        通過主成分分析和聚類分析,花蕾和葉成為一類,它們作為西洋參地上部分,其人參皂苷組分較為相近,而他們與莖組分含量卻差異較大,且莖中各皂苷含量均較少,此結(jié)果可以為西洋參地上部分資源的合理利用作指導(dǎo);西洋參地下部位自成一類,它們大多皂苷含量較多,且成分組成較為接近,為西洋參資源利用的主要來源。

        西洋參皂苷是西洋參中最主要的有效成分之一,也是生理活性最顯著的物質(zhì),廣泛分布于各個(gè)部位。由于生長環(huán)境的不同,如土壤類型、氣候條件的不同,會(huì)使有效成分類型及含量分布出現(xiàn)較大差異[6],通過西洋參各部位皂苷含量分析,明確各部位含量差異,可選擇性的對(duì)含量較高的部位進(jìn)行提取分離,并應(yīng)用于新藥開發(fā)[7],對(duì)于其資源的綜合利用有重要意義。

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