高 瑩 ，張晶璇 ，黃 羚

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

玉米須是禾本科植物玉蜀黍（Zea mays L.）的花柱和柱頭，味甘、淡，性平，歸膀胱、肝、膽經(jīng)，具有利尿消腫，清肝利膽的功效[1]。明代醫(yī)藥家蘭茂最先記載其于《滇南本草》，2010版《中華人民共和國(guó)藥典》將其收入為利尿中藥，《浙江民間草藥》等地方藥志記載其有治療水腫，糖尿病等作用。因其價(jià)格低廉、無(wú)不良反應(yīng)[2]，亦食亦藥，受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，玉米須在糖代謝疾病中的應(yīng)用報(bào)道日漸增多[3]，多數(shù)研究多停留在藥效學(xué)研究層面，對(duì)于其干預(yù)糖尿病的活性成分的研究仍是一片空白，且其作用機(jī)制的研究尚未深入，不利于玉米須的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病病因復(fù)雜多樣，包括遺傳因素、環(huán)境因素等，是最常見(jiàn)的“生活方式疾病”。全球約有4.25億糖尿病患者[4]，他們當(dāng)中許多人面臨著病情進(jìn)展帶來(lái)的腎臟、心臟、血管、眼部、神經(jīng)等損害，胰島素是目前治療糖尿病的最有效方法，但胰島素療法無(wú)法逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展過(guò)程，更無(wú)法徹底治愈，同時(shí)存在不良反應(yīng)大等弊端，因此，從中醫(yī)藥寶庫(kù)中挖掘干預(yù)糖尿病的有效方劑從而達(dá)到中西醫(yī)結(jié)合使用減少西藥副作用，提高糖尿病臨床療效變得尤有意義。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘玉米須的主要活性，探討活性成分的作用靶標(biāo)與糖尿病的關(guān)聯(lián)性，探討玉米須對(duì)糖尿病的多成分-多靶標(biāo)-疾病的干預(yù)作用機(jī)制，為其開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 玉米須的活性成分和靶標(biāo) 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP），以“玉米須”為關(guān)鍵詞檢索其活性成分及靶標(biāo)。以口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選出活性成分，提取玉米須各活性成分的靶標(biāo)，形成中藥-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.2 疾病-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用人類(lèi)表型術(shù)語(yǔ)集（HPO）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(kù)（CTD）和 TCMSP，以“diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞檢索其靶標(biāo)，用于完成疾病及靶標(biāo)間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建工作。并通過(guò)全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt）翻譯成相應(yīng)基因。

1.3 各靶標(biāo)間相互作用關(guān)系的構(gòu)建 將交集后中藥-疾病靶標(biāo)在相互作用基因/蛋白質(zhì)的檢索工具網(wǎng)站（STRING）中，選擇“multiple proteins”后，輸入相關(guān)靶標(biāo)名稱，在“organism”中選擇“homo sapiens”進(jìn)行檢索，得到相應(yīng)蛋白關(guān)系圖，選擇“molecular action”進(jìn)行分析，記錄蛋白間相互作用類(lèi)型及得分。

1.4 GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析 在STRING平臺(tái)進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）的信號(hào)通路富集分析和基因本體（GO）的生物過(guò)程富集分析，以P＜0.05進(jìn)行靶基因篩選，分析玉米須發(fā)揮藥理作用的主要信號(hào)通路及生物過(guò)程。

2 結(jié)果

2.1 玉米須主要活性成分 篩選出玉米須主要活性成分12種，使用化學(xué)文摘社（CAS）以及化學(xué)信息搜索（Pubmed Chemicalbook，Pubchem）進(jìn)行結(jié)構(gòu)和化合物類(lèi)型確認(rèn)，共有主要為黃酮類(lèi)、甾體衍生物、玉米黃素和脂肪酸類(lèi)。見(jiàn)表1。

表1 玉米須主要活性成分Tab.1 Main active components of Maydis Seigma

2.2 各靶標(biāo)間的相互作用 通過(guò)檢索，得到玉米須的靶標(biāo)基因?yàn)?2個(gè)，糖尿病的靶標(biāo)基因?yàn)?02個(gè)，經(jīng)交集顯示，藥物-疾病交集靶標(biāo)基因?yàn)?個(gè)。玉米須的潛在靶標(biāo)與糖尿病疾病靶標(biāo)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息（PPI）通過(guò)STRING獲得。網(wǎng)絡(luò)中包含8個(gè)節(jié)點(diǎn)，平均度值為1.75。見(jiàn)圖1。其中，有7項(xiàng)相關(guān)靶標(biāo)的相互作用，見(jiàn)表2。

圖1 基于STRING的藥物—疾病靶標(biāo)相互作用圖Fig.1 Drug-disease target interaction map based on STRING

表2 玉米須干預(yù)糖尿病的相關(guān)靶標(biāo)相互作用（關(guān)系系數(shù)≥0.455）Tab.2 PPI of Maydis Seigma intervention in diabetes mellitus（correlation coefficient≥ 0.455）

2.3 玉米須干預(yù)糖尿病的GO功能富集 對(duì)交集靶標(biāo)基因進(jìn)行GO生物過(guò)程富集，篩選到P＜0.05的GO條目87個(gè)，按照P值由小到大排列的前20條主要生物過(guò)程見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，其GO基因生物功能主要涉及：血糖穩(wěn)態(tài)；對(duì)體內(nèi)外多種有機(jī)物、無(wú)機(jī)物的反應(yīng)例如細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)、對(duì)氧的反應(yīng)、對(duì)脂肪酸的反應(yīng)、肽類(lèi)激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)；脂肪代謝相關(guān)生物過(guò)程包括棕色脂肪細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞分化的正調(diào)控、脂肪酸代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、脂代謝過(guò)程的正調(diào)節(jié)、前體代謝物和能量生成調(diào)控；一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控；細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控；飲食誘導(dǎo)發(fā)熱；運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控；生殖發(fā)育過(guò)程、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育。

2.4 玉米須干預(yù)糖尿病的KEGG信號(hào)通路分析 篩選出P＜0.05的信號(hào)通路共37條，按照P值由小到大排列的前20條主要KEGG信號(hào)通路見(jiàn)圖2。糖尿病相關(guān)通路2條：胰島素信號(hào)通路、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路；循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路4條：腎上腺素在心肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)張型心肌病、VEGF信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路；癌癥相關(guān)通路3條：癌癥的途徑、小細(xì)胞肺癌、Ras信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路；內(nèi)分泌相關(guān)信號(hào)通路3條：卵巢類(lèi)固醇激素分泌、雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟；炎癥相關(guān)信號(hào)通路1條：TNF信號(hào)通路；神經(jīng)遞質(zhì)通路1條：膽堿能突觸。另有通訊連接、細(xì)胞凋亡、唾液分泌、蛋白質(zhì)的消化和吸收等通路可能是玉米須干預(yù)糖尿病的途徑。

圖2 玉米須干預(yù)糖尿病的KEGG主要相關(guān)通路注釋圖Fig.2 Chart of KEGG major related pathways of Maydis Seigma intervention in diabetes mellitus

其中，結(jié)果顯示RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、胰島素受體（INSR）和 cAMP 依賴性蛋白激酶催化亞單位α（PRKACA）參與了胰島素信號(hào)通路。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）和AKT1、INSR參與了AMPK信號(hào)通路。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 胰島素信號(hào)通路參與2型糖尿病的過(guò)程Fig.3 Insulin signaling pathway involved in the process of type 2 diabetes mellitus

玉米須有“食物中的降糖藥”之稱，在2015年之前一直被作為利尿類(lèi)中藥寫(xiě)入《中華人民共和國(guó)藥典》，其利尿消腫，清肝利膽的功效明確，臨床運(yùn)用廣泛[5-7]。本研究篩選出玉米須最主要的活性成分為黃酮類(lèi)、甾體衍生物、玉米黃素和脂肪酸類(lèi)。文獻(xiàn)支持黃酮類(lèi)為玉米須降血糖的主要活性成分，也是被研究最多、運(yùn)用范圍最廣的玉米須成分[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]，黃酮類(lèi)成分除了有降血糖的作用以外，還有抗氧化作用、清除自由基、抗病毒等藥理作用。研究者認(rèn)為[10]玉米須的抗氧化作用能夠減輕四氧嘧啶對(duì)胰島β-細(xì)胞損傷程度，從而提高胰島的分泌功能達(dá)到降血糖作用。這與本研究GO富集預(yù)測(cè)得出的玉米須可能通過(guò)對(duì)氧的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)等生物過(guò)程干預(yù)糖尿病密切相關(guān)。玉米黃素也具有很強(qiáng)的抗氧化性，同時(shí)又是構(gòu)成視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的主要色素成分，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的黃斑變性治療上可作為保護(hù)因素[11]。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出玉米須主要活性成分12種及靶標(biāo)92個(gè)，涉及糖尿病的靶標(biāo)有8個(gè)。KEGG分析顯示靶基因主要分布于糖尿病、循環(huán)系統(tǒng)、癌癥、炎癥等4大類(lèi)14條通路，以及其他與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)代謝和細(xì)胞存活相關(guān)的通路。本研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病相關(guān)通路主要是胰島素信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路，胰島素信號(hào)通路是一條很重要的2型糖尿病通路，根據(jù)KEGG胰島素信號(hào)通路參與2型糖尿病的過(guò)程。

AMPK是糖代謝的主要調(diào)控分子，在細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。張利軍等人的研究表明[12]，黃酮類(lèi)能夠通過(guò)激活A(yù)MPK通路使糖代謝關(guān)鍵基因PEPCK和G6Pase低表達(dá)從而抑制糖異生代謝。AMPK信號(hào)通路常被視為2型糖尿病潛在治療途徑[13]。

本研究通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)多途徑參與糖尿病的重要蛋白。AKT1是細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路中的傳感器，AKT1作用在胰島素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，能夠防止胰島素受體去磷酸化，調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)。研究表明AKT1參與葡萄糖儲(chǔ)存環(huán)節(jié)，在血糖穩(wěn)態(tài)中扮演重要的角色。本研究發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)重要蛋白胰島素受體是介導(dǎo)胰島素的關(guān)鍵蛋白。胰島素受體參與兩條主要信號(hào)通路[14]，在PI3K-AKT/PKB通路中調(diào)節(jié)胰島素代謝，在Ras/RAF/MAP2K/MAPK通路中調(diào)節(jié)胰島素的細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化，與葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)密切相關(guān)，是2型糖尿病發(fā)病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本研究篩選出了AKT參與的通路，也預(yù)測(cè)到了Ras信號(hào)通路，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合。除此之外，還有PRKACA和PRARG蛋白分別參與了胰島素信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路，說(shuō)明玉米須通過(guò)多種蛋白多途徑干預(yù)糖尿病。

4 結(jié)論

研究表明，玉米須的主要活性成分可針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路發(fā)揮干預(yù)糖尿病的作用，其作用可能與胰島素信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路等有關(guān)，相關(guān)靶點(diǎn)及通路和現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道較為一致。本研究還表明，草果知母湯的潛在作用靶點(diǎn)提示其在循環(huán)系統(tǒng)、癌癥、炎癥的治療中有一定的應(yīng)用價(jià)值。盡管玉米須在最新版藥典中被剔除，市場(chǎng)各類(lèi)以玉米須為原料的保健品、食品層出不窮，獲得了消費(fèi)者的喜愛(ài)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)為玉米須是安全、無(wú)毒的草本，玉米須提取物所制的藥品也被認(rèn)為是非處方藥，受到國(guó)際認(rèn)可。研究為進(jìn)一步玉米須干預(yù)糖尿病作用機(jī)制相關(guān)研究提供參考依據(jù)，同時(shí)為藥食同源中藥的研究開(kāi)發(fā)提供借鑒。局限性在于本研究是基于大數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)所做的預(yù)測(cè)，其降糖作用還需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以佐證。