鮑緒杰 朱蘇雨 陳曉艷 劉科 周菊梅 吳崢 劉媛媛

局部進展期直腸癌標準治療方式為術前新輔助放療和化療后再擇期行全直腸系膜切除術（total mesorectal excision，TME）。有研究提出對于新輔助放化療達到臨床完全緩解（clinical complete regression，cCR）的患者可“等待和觀察”，僅對其中“再生長”患者行挽救性手術治療，其療效和標準治療相當，且能免除部分患者的手術并保留肛門功能從而提高生存質(zhì)量［1-2］。因此，如何提高cCR率成為近期直腸癌新輔助治療臨床研究熱點。有薈萃分析表明，cCR率與直腸癌局部放療劑量呈線性關系［3］。但高劑量放療常受限于腫瘤周邊正常組織的放療并發(fā)癥。因此，如何精確確定大體腫瘤周邊微小癌灶距離(clinical target volume，CTV)是放療成功的關鍵。即明確CTV 在原發(fā)大體腫瘤體積（gross tumor volume，GTV）基礎上外擴距離。手術病理標本為測量和檢驗此距離的“金標準”，尚缺乏直腸癌影像和病理標本的病例對照研究。因而目前直腸癌放療中CTV的外擴范圍尚缺乏統(tǒng)一共識，通常是四周外擴1.5～2 cm、上下兩端各外擴2～3 cm，這可能導致大量正常器官接受不必要的高劑量放射。

為嘗試解決上述問題，本研究測量直腸癌病理標本大體腫瘤外周微小癌灶距離，并將直腸癌術前影像與術后病理標本一一對應，計算手術標本“在體-離體”和病理標本處理過程退縮因子，經(jīng)退縮因子校正后得出“在體”微小癌灶延伸距離（microcarcinoma extension measuredin vivo，MEinvivo），從而為直腸癌后程高劑量放療GTV外擴成CTV提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析2016年10月至2017年4月在湖南省腫瘤醫(yī)院行TME手術的28例直腸癌患者。納入標準：1）根據(jù)MRI臨床分期≥T3；2）術前未接受放療、化療和手術等治療；3）術前腸鏡提示為直腸單發(fā)腫瘤，排除多生發(fā)中心癌；4）術后病理診斷為腺癌。排除標準：1）有遠處轉(zhuǎn)移和多重癌；2）有MRI禁忌證或嚴重疾病無法耐受手術者。

1.2 方法

1.2.1 術前影像獲取 患者取仰臥位，均行術前盆腔增強序列MRI。MRI 圖像上以T2WI 腸壁增厚，直腸壁黏膜、黏膜下層及肌層信號帶異常作為GTV 勾畫標準。由兩位消化道腫瘤影像診斷醫(yī)師對腫瘤進行判定，當存在較大差異時，相互協(xié)商或請第三位醫(yī)師進行確認。

1.2.2 病理標本處理過程 大體標本：28例患者均行TME手術，術后即時標本沿腫瘤主體對側(cè)縱向剖開，隨后將腫瘤切成均厚5 mm組織薄片，隔片取材，每片均由腸腔內(nèi)向外取直腸系膜全層，向上下兩端延伸包括肉眼腫瘤邊緣外至少2 cm正常腸組織。在無外力影響下，結合腫瘤與周邊正常組織解剖關系，將所得組織薄片盡可能復原與活體空間位置相當，以大頭針固定于泡沫板?？紤]臨床實際，直腸癌側(cè)方及上下方向微小癌灶測量方式有別，故沿大體腫瘤邊緣垂直于直腸系膜將其分為大體腫瘤側(cè)方、下方和上方（basis of measurement，BM）（圖1）。另取腫瘤帶直腸系膜筋膜組織一片，在腫瘤橫斷面中點打一手術線結作為標準點Ax，在系膜筋膜四角及標準點下方各打一手術線結作為參考點Bx（1，2，3，4，5），以相同方式固定（圖2）。最后，將整塊泡沫板倒置于10%福爾馬林固定液24 h，脫水、浸蠟、包埋制成蠟塊。

圖1 腫瘤“離體”和“在體”厚度測量與R1的計算

圖2 R2的測量與計算

病理標本：所得蠟塊連續(xù)切片（厚度為4 μm），所有切片均予伊紅和美藍染色，由高年資病理科醫(yī)師在不借鑒任何資料的情況下，首先在低倍鏡下總覽整個切片，勾畫出原發(fā)大體腫瘤邊緣，若原發(fā)灶邊緣呈小毛刺狀浸潤，則貼近毛刺根部勾畫，同時在病理切片上勾畫出最遠微小癌灶，其定義為顯微低倍鏡下大體腫瘤邊緣外癌細胞和癌巢外延距離，微小癌灶包括腫瘤出芽（＜5個癌細胞團）、腸周癌結節(jié)、淋巴管侵犯形成的癌結節(jié)、血管侵犯形成的癌結節(jié)和神經(jīng)鞘侵犯形成的癌結節(jié)。直腸癌大體腫瘤下方和上方實測微小癌灶延伸距離為最遠微小癌灶距BM最近直線距離（microcarcinoma extension measured inferiorly/microcarcinoma extension measured superiorly，MEmi/MEms）；直腸癌側(cè)方實測微小癌灶延伸距離為最遠微小癌灶距原發(fā)大體腫瘤邊緣最近直線距離（microcarcinoma extension measured laterally，MEml）（圖3A）。

1.2.3 腫瘤組織退縮因子計算 直腸癌行TME手術及術后標本制成病理切片過程存在腫瘤變形和退縮，其退縮因子分為兩步計算：在體腫瘤經(jīng)由手術離體后，因缺乏周圍盆腔筋膜的牽拉發(fā)生第一次退縮，將此定義為“在體-離體”退縮因子（R1）；離體腫瘤在制成病理標本過程中由于組織脫水發(fā)生第二次退縮，稱為病理退縮因子（R2）。

圖3 微小癌灶距離測量示意圖及微小癌灶類型

R1的測算：取直腸癌即時標本最中間組織片（圖1A），紅色區(qū)域為大體腫瘤，綠色區(qū)域為正常腸黏膜，腫瘤中點垂直于直腸系膜的黃色實線代表離體腫瘤厚度，標記為Dpath。獲取患者所有腫瘤出現(xiàn)層面的MRI T2WI影像（層厚3 mm，層距1 mm），選取最中間層面（圖1B），其中紅色區(qū)域代表大體腫瘤，腫瘤中點垂直于直腸系膜的黃色實線代表腫瘤在體厚度，標記為DMR。據(jù)此R1采用如下公式計算：R1=Dpath/DMR。

R2的測算（圖2）：通過即刻術后標本及組織蠟塊上Ax與Bx（1，2，3，4，5）各點間相對位置的改變計算R2，其公式為：

MEinvivo計算：通過逐例計算R1、R2、MEmi、MEms、MEml，則MEinvivo=MEmi/（R1×R2）或MEms/（R1×R2）或MEml/（R1×R2）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計28例患者大體腫瘤側(cè)方、下方、上方MEinvivo及95%頻數(shù)值。

2 結果

2.1 病理特征

研究共納入28例患者，臨床病理特征見表1。其中男性17 例（60.7%），女性11 例（39.3%），平均年齡61.9（41～80）歲。腫瘤分布以中低位直腸癌為主（19例），腫瘤分化以中分化為主（24 例），有腸旁淋巴結轉(zhuǎn)移者13例（46.4%）。

表1 28例直腸癌患者臨床病理資料

2.2 微小癌灶類型統(tǒng)計及MEin vivo

28例直腸癌患者中，在大體腫瘤側(cè)方、下方主上方可觀察到微小癌灶者分別為17 例（60.7%）、3 例（10.7%）和0。微小癌灶最常見的類型為淋巴管性癌結節(jié)12例（42.9%）、腫瘤出芽9例（32.1%）、腸周癌結節(jié)5例（17.9%）、血管性癌結節(jié)2例（7.1%）、神經(jīng)源性癌結節(jié)0 例（圖3B～E）。經(jīng)兩種退縮因子校正后，MEinvivo在大體腫瘤下方者有3 例，分別為23.24 mm、11.32 mm 和28.06 mm；MEinvivo在大體腫瘤側(cè)方者有17例，其最大值為12.03 mm，最小值為3.13 mm，平均值為7.50 mm（表2）。根據(jù)頻數(shù)表法，28 例患者側(cè)方微小癌灶侵襲范圍95%頻數(shù)值在10 mm內(nèi)（表3）。

表2 17例患者大體腫瘤側(cè)方微小癌灶類型、距離、退縮因子及MEin vivo

表3 28例患者大體腫瘤側(cè)方MEin vivo頻數(shù)值

3 討論

局部晚期直腸癌標準治療模式推薦為術前聯(lián)合放化療加TME［4］。出于患者生存質(zhì)量和功能保全的考慮，經(jīng)新輔助治療達cCR后行“等待和觀察”有望成為其治療新策略。此策略由Habr-Gama等［5］于2004年首次報道265例低位直腸癌患者行新輔助同步放療和化療，71例（27%）達cCR，行“等待和觀察”，其5年總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease free survival，DFS）優(yōu)于未達cCR選擇手術的患者。近期一項涉及15個國家47家獨立研究機構的“等待和觀察”數(shù)據(jù)顯示，880例達cCR的直腸癌患者采用“等待和觀察”策略，其5年OS為85%，5年DFS為94%［1］。據(jù)此可見，經(jīng)新輔助治療達cCR后行“等待和觀察”與傳統(tǒng)手術患者的療效相當，而無造口生存期顯著延長，這成為中低位進展期直腸癌的治療新選擇，其優(yōu)勢在于避免了手術和手術相關的并發(fā)癥，并維持了較好的療效和較高的生存質(zhì)量；其不足之處為cCR率（27%～78%）因治療強度導致不同研究報道差異較大［5-8］。因此，如何獲得穩(wěn)定且高效的cCR率成為近期研究熱點。Appelt等［8］采用高劑量放療（直腸病灶60 Gy/30次，淋巴結預防區(qū)域50 Gy/30次，腔內(nèi)照射推量5 Gy），同步口服卡培他濱化療，入組51例低位直腸癌患者（T2～3N0～1M0），其中40例（78%）達cCR，行“等待和觀察”，1年局部復發(fā)率為15.5%，均成功行外科手術解救治療。一項關于直腸癌放療強度與cCR率的量效研究［9］發(fā)現(xiàn)，放療反應率在放療劑量達60 Gy后呈指數(shù)增長，當放療劑量達92 Gy時，約50%患者可達cCR，認為提高局部放療劑量可以提升直腸癌cCR率。但較大范圍照射靶區(qū)接受高劑量放療有可能影響手術并增加手術并發(fā)癥，對低位直腸癌也可能影響肛門括約肌復合體的功能，從而影響患者治療后的生存質(zhì)量。因此，如何精確確定直腸癌原發(fā)大體腫瘤及其亞臨床病變范圍顯得尤為關鍵。病理標本為檢測此范圍準確性的“金標準”，但既往關于直腸癌大體腫瘤周邊微小癌灶分布情況的研究，其方法學均存在不足：大部分研究僅考慮直腸癌上方和下方的微小癌灶，忽略了微小癌灶分布密度最高的直腸癌側(cè)方，使得最終測量結果存在遺漏［10-11］；另外部分研究［12-13］直接將固定后病理標本中微小癌灶與大體腫瘤之間距離定義為微小癌灶距離，忽視了手術切除和病理標本處理過程中直腸腫瘤組織退縮。本次研究結果表明，直腸癌手術標本R1平均值為0.913，R2平均值為0.803，忽視上述兩部分退縮顯然不恰當。因此，在充分考慮上述不足的基礎上，本研究建議如下改進：1）沿腸管長軸方向?qū)⒋篌w腫瘤連同完整直腸系膜切成均厚5 mm組織薄片，使每片薄片同時含有腫瘤組織與直腸系膜，以保證可同時測量大體腫瘤側(cè)方、下方和上方微小癌灶距離；2）首次應用MRI影像和即刻術后標本計算R1及“線結標記法”計算R2，將術前影像與術后病理標本一一對應，從而更精確測量和計算MEinvivo，為直腸癌術前高劑量放療精確勾畫CTV邊徑提供科學數(shù)據(jù)參考。

本研究微小癌灶檢出率為60.7%（17/28），高于繼往研究結果（17%～43%）［14-16］，這與標本收集時，取材的傾向性有關，本研究初期入組42例，在后續(xù)病理切片制作時，排除14例腸管壁肌層連續(xù)者（即病理分期≤pT2），最終入組28例（包含5例pT2，但直腸肌層連續(xù)性中斷病例）。在提高微小癌灶檢出率的同時也提升最終結果的臨床意義。參照既往研究分類［15-17］，本研究中所定義的微小癌灶包括腫瘤出芽（32.1%）、腸周癌結節(jié)（17.9%）、淋巴管性癌結節(jié)（42.9%）、血管性癌結節(jié)（7.1%）和神經(jīng)源性癌結節(jié)（0），本次標本中并未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性癌結節(jié)，這與標本數(shù)量有限有關。

經(jīng)各自退縮因子校正后，3例患者大體腫瘤下方MEinvivo分別為23.24 mm、11.32 mm 和28.06 mm，由于在體最遠距離為28 mm。因此，CTV邊徑在上下兩端外放時，30 mm 的距離已足夠覆蓋靶區(qū)，這與Ono等［15］的結果一致。17例患者大體腫瘤側(cè)方MEinvivo平均為7.50 mm，64.7%（11/17）的病例距離分布在6～10 mm 之間，若＞10 mm，其微小癌灶密度急劇下降。根據(jù)28例直腸癌患者側(cè)方微小癌灶距離頻數(shù)分布情況，可知側(cè)方微小癌灶侵襲范圍95%頻數(shù)值在10 mm內(nèi)，說明直腸癌后程高劑量放療靶區(qū)在前后左右方向GTV 外擴CTV 時邊徑僅需10 mm。大部分放療科醫(yī)師在此方向外擴值為15～20 mm，通常包括整個直腸系膜區(qū)，結合本研究結果，這種外擴邊徑在直腸癌后程局部推量放療時顯得過大。此外，受限于入組病例例數(shù)，本研究暫無法行腫瘤的病理分級及臨床分期與其外侵范圍相關性分析，且既往文獻尚缺乏相關報道，后續(xù)擴充樣本量以明確外侵范圍與兩者間關系。最后，本研究在測量直腸標本“在體-離體”退縮上仍存在不足：由于MRI 掃描層厚及層間距的原因，影像與病理標本上所測腫瘤層面存在一定誤差，導致最終所測微浸潤距離存在細微偏差，如果在腫瘤中心及四周植入金屬標記物，在體影像和離體組織中，其相對距離的改變將能更為精準的測量“在體-離體”組織的退縮因子。

綜上所述，本研究從病理標本測量報道28 例直腸癌患者側(cè)方微小癌灶侵襲范圍95%頻數(shù)值在10 mm 內(nèi)。建議直腸癌后程高劑量放療靶區(qū)在前后左右方向GTV外擴成CTV時邊徑為10 mm。